甘蓝型油菜BnCOP基因编码区全长cDNA的克隆与功能的初步研究

摘要

光对植物生长发育起重要的作用,植物体内存在非常精巧的光信号调节网络感受光的强度、方向、光质及周期长度等从而影响植物的形态建成、开花诱导及生物节律等。已深入研究的模式植物拟南芥AtCOP1蛋白是光信号调节网络中介导光信号转导的一个关键因子,也是光调控植物发育的分子开关。但有关光形态建成基因的研究在重要油料作物一油菜中还相对滞后,其体内是否也存在COP1蛋白,结构和功能以及作用机制是否与拟南芥AtCOP1完全一致仍然未知。因此,本文以甘蓝型油菜为对象,从基因克隆入手展开研究,获得了如下结果：
　　 ⑴根据拟南芥、水稻、豌豆和番茄的COP1cDNA序列的保守区段,运用RT-PCR方法、改进的基因组步行(genome walking)技术以及结合已知的油菜数据库序列,从甘蓝型油菜中克隆到BnCOP1编码区cDNA的全长序列,其全长为2034bp,编码677个氨基酸。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥的同源性高达94％。
　　 ⑵利用生物信息学方法分析了BnCOP1编码序列演绎出的氨基酸序列。BnCOP1蛋白可能定位在细胞核,其二级结构、功能域甚至三级结构都与拟南芥AtCOP1极为相似,且3个特征性结构域尤为保守,即N端的环形锌指结合域(RING)、中间的卷曲螺旋形结构域(coiled-coil),7个C-端的WD-40重复序列(WD-40)。
　　 ⑶采用相对定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析了BnCOP1基因在甘蓝型油菜中的表达模式。两种方法分析结果一致,BnCOP1在野生型甘蓝型油菜的各个组织都有表达,其中在花中的表达明显高于根、叶、茎、果荚及子叶和胚轴。
　　 ⑷构建了原核表达重组载体pCold TF/BnCOP1,并用IPTG法低温诱导表达了融合蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子质量约为128 kD,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了高纯度的重组蛋白。
　　 ⑸构建了过表达载体35S:BnCOP1-GFP,并用浸花蕾法将其导入拟南芥,获得了纯合的转基因植株。通过植株的表型观察及数据统计分析,发现过表达BnCOP1的植株在高度、主茎的直径和叶片大小上都比野生型的小。
　　 ⑹通过分析BnCOP1对光调节的抑制下胚轴伸长的应答发现BnCOP1只对红光敏感,在红光下提高幼苗的光形态建成,对远红光和蓝光不敏感。这些结果表明BnCOP1在对光调节的抑制下胚轴伸长的功能方面不同于拟南芥AtCOP1。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词

第1章 绪论

1.1 甘蓝型油菜的分子生物学研究

1.1.1 甘蓝型油菜的生物学特征

1.1.2 转基因技术在甘蓝型油菜育种中的应用

1.2 COP1的研究进展

1.2.1 COP1在拟南芥中的研究

1.2.2 COP1在其他植物中的研究

1.2.3 COP1在动物和人体中的研究

1.3 本论文的研究内容及意义

第2章 甘蓝型油菜BnCOP1基因编码区全长cDNA的克隆与表达分析

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 BnCOP1基因编码区全长cDNA序列的获得

2.2.2 BnCOP1编码的蛋白质的生物信息学分析

2.2.3 BnCOP1基因的表达特异性分析

2.3 本章小结

第3章 甘蓝型油菜BnCOP1基因的原核表达和纯化

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 BnCOP1基因的克隆与的原核表达载体的构建

3.2.2 pCold TF/BnCOP1原核表达产物的SDS-PAGE检测

3.2.3 pCold TF/BnCOP1原核表达条件的优化

3.2.4 可溶性重组蛋白pCold TF/BnCOP1的纯化

3.2.5 Western blotting检测融合蛋白的表达

3.3 本章小结

第4章 甘蓝型油菜BnCOP1基因功能的初步研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 过表达载体35S::BnCOP1-GFP的构建

4.2.2 过表达BnCOP1拟南芥植株的获得

4.2.3 BnCOP1转基因拟南芥对光敏感性的分析

4.2.4 BnCOP1转基因拟南芥成年植株的表型分析

4.3 本章小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢