慢病毒Rev蛋白拮抗TRIM5α激活的AP--1通路的机制研究

摘要

TRIM5α(Tripartite motif protein5α)是TRIM蛋白家族重要成员，具有E3泛素连接酶活性。TRIM5α同时是一种具有限制HIV-1等逆转录病毒复制的宿主因子。TRIM5α存在于细胞质中，当病毒进入细胞之中后，TRIM5α一方面可以利用其SPRY结构域特异性结合逆转录病毒的衣壳蛋白并破坏其结构，阻止病毒复制;另一方面，TRIM5α也可以利用其RING结构域的E3泛素连接酶活性招募E2泛素结合酶UBCI3/UEV1A，催化形成K63连接的多聚泛素链，招募TAK1激酶和TAK1结合蛋白2（TAK1binding protein2，TAB2）和TAB3，激活TAK1和随后的MAPK激酶级联反应，激活AP-1和NF-κB信号通路，而发挥抗病毒作用。RhTRIM5α识别病毒衣壳并激活强烈的天然免疫，而病毒是否存在一种蛋白或机制抑制TRIM5α激活的天然免疫还没有报道。 为了探究慢病毒中是否存在能够拮抗RhTRIM5α激活的天然免疫的机制，发现马传染性贫血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)的Rev蛋白能显著下调RhTRIM5α激活的AP-1信号通路。Rev蛋白是慢病毒的重要辅助蛋白之一，主要承担在病毒复制晚期向核外转运未完全剪切的mRNA的作用，以促进病毒的组装。不同病毒Rev蛋白序列差异很大，但均具有核定位信号(NLS)、RNA结合域(RBD)和核输出信号(NES)。 EIAV是HIV重要的病毒研究模型，RhTRIM5α可以限制HIV和EIAV的复制，本实验针对EIAV和RhTRIM5α开展其机制研究。为了探究EIAV的Rev蛋白通过何种方式下调RhTRIM5α激活的AP-1信号通路。通过在293T细胞中分别共转染表达RhTRIM5α和EIAV Rev的质粒，通过Western blot检测RhTRIM5α蛋白表达情况。结果表明，EIAV Rev蛋白不影响RhTRIM5α的表达，同时免疫共沉淀实验表明，EIAV的Rev蛋白不能与RhTRIM5α相互作用。之后，进一步对Rev蛋白是否影响TRIM5α信号通路下游关键蛋白进行了研究，发现EIAV Rev蛋白可以下调TAK1、TAB2、P38激活的AP-1信号通路，但不下调c-Jun激活的AP-1信号通路。Western blot表明，EIAV Rev降解P38蛋白，但不影响RhTRIM5α、TAK1、TAB2、TRAF6蛋白的表达。进而发现，蛋白酶体抑制剂MG132可以抑制EIAV Rev对P38的降解作用，而溶酶体抑制剂氯喹不能抑制此降解。 为了确定Rev降解P38蛋白的关键区域，通过利用EIAV Rev截短突变体与P38质粒共转染293T细胞，发现EIAV Rev的中间端和C端对于降解P38蛋白发挥重要作用，同时NLS功能域也起重要作用。同时激光共聚焦实验发现，EIAV Rev改变了P38蛋白的亚细胞定位。 本研究是对慢病毒拮抗TRIM5α激活的AP-1信号通路的初步探索，为进一步理解病毒与宿主蛋白相互作用及逃逸机制提供了理论依据。