两株不同H7N9病毒抗宿主天然免疫比较研究

摘要

H7N9流感病毒自2013年发现报道以来，已经对家禽养殖业造成了巨大的经济损失，而且病毒可以突破种间屏障，造成人的感染和发病死亡，给公共卫生安全造成了巨大的威胁。宿主的天然免疫系统在抗病毒感染的过程中发挥重要作用，比较研究不同宿主来源的H7N9流感病毒拮抗宿主天然免疫的差异，可以更好地了解病毒与宿主的相互作用，为制定防控措施提供新的思路和科学依据。 为更好地了解H7N9流感病毒在拮抗宿主天然免疫方面的差异，本实验选取两株不同宿主来源的H7N9流感病毒作为模式病毒株，分别是禽源病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(H7N9)[PG/S1421]和人源病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)[AH/1]。两株病毒只在PB2蛋白的627位点存在一个氨基酸的差异，PG/S1421是627位谷氨酸(E)，而AH/1是627位赖氨酸(K)，但是这两株病毒对哺乳动物的致病性表现出明显的差异性。 用不同剂量的两株流感病毒感染C57BL/6小鼠，连续记录小鼠的体重变化和死亡率，实验结果显示，AH/1可以造成小鼠的发病死亡，而PG/S1421则不会造成小鼠发病。病毒感染后的小鼠，肺部病理损伤程度存在差异，用ELISA实验对肺部Ⅰ型干扰素水平进行检测，发现两株病毒均可以在肺部诱导Ⅰ型干扰素的产生，但是AH/1感染导致肺部的Ⅰ型干扰素含量更高。为了确定两株流感病毒诱导产生Ⅰ型干扰素的主要通路，用Ⅰ型干扰素信号通路关键分子的基因缺失小鼠，取腹腔巨噬细胞，经病毒感染后，检测Ⅰ型干扰素产生情况，检测结果显示，两株流感病毒感染主要是通过RIG-Ⅰ/MAVS/IRF3这一信号通路产生Ⅰ型干扰素的。 为进一步研究PG/S1421和AH/1诱导宿主产生Ⅰ型干扰素差异的原因，首先构建了两株表达PG/S1421和AH/1的PB2蛋白的A549细胞系，用两株病毒进行感染，检测IFN-β的mRNA水平，结果发现两者对Ⅰ型干扰素产生的影响不存在显著差异，表明PB2的627位点单一氨基酸差异不是造成AH/1诱导更多Ⅰ型干扰素的主要原因。然后用两株病毒以相同剂量感染A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞，间接免疫荧光和细胞流式实验检测均显示感染效率无明显区别，表明Ⅰ型干扰素产生的差异并不是由于感染效率导致的。最后用两株流感病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞，收集上清液和细胞蛋白，ELISA实验检测上清液中IFN-β的含量，用western blotting实验检测干扰素产生通路上关键分子的表达情况，发现两株H7N9流感病毒感染腹腔巨噬细胞均会诱导Ⅰ型干扰素产生，但是AH/1可以诱导更多Ⅰ型干扰素产生，而且AH/1感染可以上调RIG-Ⅰ的表达量，PG/S1421感染对于RIG-Ⅰ的表达量则没有明显影响。 本研究结果表明，禽源病毒PG/S1421感染不会造成小鼠发病，人源病毒AH/1感染则可以造成小鼠的发病和死亡，两株病毒均可诱导Ⅰ型干扰素产生，但是在抗宿主天然免疫方面存在差异。AH/1感染可以通过上调RIG-Ⅰ的表达，进而促进Ⅰ型干扰素的产生，在宿主体内具有更高的病毒滴度提示AH/1可能逃逸了宿主天然免疫的清除，实验发现了人源流感病毒促进Ⅰ型干扰素产生的初步机制，为以后更精确的分子机制研究和流感防控提供了新的思路。