报告型重组寨卡病毒的构建及在抗病毒药物筛选中的应用

摘要

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一种重要蚊媒传播的人兽共患病病原，人、灵长类以及兔和猪对其易感，其感染宿主后能引起寨卡热，大多数感染者并没有明显症状或者症状较为轻微，但若在妊娠期间发生ZIKV感染，则可能导致新生儿出生缺陷，同时还可能造成妊娠者发生流产和早产等严重症状。目前，ZIKV在全球范围内呈蔓延趋势，我国虽无相关重大疫情的报道，但有相关研究显示，新生仔猪对于ZIKV易感，这使我国生猪养殖业面临着重大经济损失的风险。ZIKV在全球范围内尚无特异性治疗药物，亦无人用ZIKV疫苗，因此，开展ZIKV相关防控研究迫在眉睫。 本研究根据GenBank公布的ZIKV（FSS13025株）基因编码序列以及密码子优化技术，将ZIKV C、prM和E蛋白基因分别克隆到pMAL-c5x载体中，构建pMAL-c5x-ZIKV-C、pMAL-c5x-ZIKV-prM和pMAL-c5x-ZIKV-E原核表达质粒。将上述三种质粒分别转化至E.coliER2523感受态细胞，经扩大培养至OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为1.0mM IPTG后继续震荡培养4h后。经SDS-PAGE电泳及western blot鉴定，发现ZIKV C、prM和E蛋白均已正确表达。重组表达蛋白经MBP亲和层析柱纯化并鉴定正确后，将重组蛋白与MONTANIDETM ISA61VG佐剂按重量比为6∶4比例充分乳化，以免疫剂量为300μg/只进行背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔，IFA和western blot结果显示，成功制备了C、prM和E蛋白多克隆抗体。 为了拯救重组ZIKV与报告型ZIKV-GFP病毒，本研究根据ZIKV基因序列，构建了复制子重组质粒pZIKVrepdCME-GFP以及pCIneo-ZIKV-CME质粒，将pCIneo-ZIKV-CME质粒PCR扩增产物和经XholⅠ线性化的pZIKVrepdCME-GFP复制子质粒共转染293T细胞，拯救ZIKV重组病毒。经电镜观察、病毒噬斑实验、western blot和IFA鉴定，结果显示成功拯救出了重组ZIKV。重组ZIKV病毒生长曲线测定实验显示，在24h-72h之间，重组ZIKV病毒滴度总体呈上升趋势，到72h时病毒滴度达最大，到96h-144h总体呈下降趋势。同时，本研究在己知黄病毒C蛋白完整性会对病毒的复制产生一定影响的基础上，我们探究了ZIKV C蛋白的N端氨基酸序列长度对病毒的复制产生的影响:ZIKV C蛋白N端38个氨基酸序列的保留对于报告型报告型ZIKV-GFP病毒的拯救具有积极意义，因此，我们构建了pCIneo-ZIKV-C38-GFP-CME质粒，将pCIneo-ZIKV-C38-GFP-CME质粒PCR扩增产物和经XholⅠ线性化的pZIKVrepdCME-GFP复制子质粒也共转染于293T细胞，电镜和噬斑试验结果显示报告型ZIKV-GFP病毒拯救成功，且报告型ZIKV-GFP病毒生长曲线测定实验显示，在24h-72h之间，报告型ZIKV-GFP病毒病毒滴度总体呈上升趋势，到72h时病毒滴度达最大，到96h-144h总体呈下降趋势。 进一步分析了报告型ZIKV-GFP病毒感染BHK-21、Vero、huh-7、A549细胞后绿色荧光强度情况:报告型ZIKV-GFP病毒在BHK-21细胞中荧光强度较为均一且相对于Vero细胞更强，但荧光数量少，然而，报告型ZIKV-GFP病毒接种A549和Huh-7细胞不仅需要大剂量而且荧光强度很不均一，因此本研究利用BHK-21细胞将pCAG-DC-SIGNR质粒用以构建稳定表达DC-SIGNR（一种可以提高囊膜病毒感染性的细胞表面的附着因子）的细胞系(BHK-DR)。报告型ZIKV-GFP病毒在BHK-DR细胞中荧光强度较强且分布均一，这为通过利用高内涵筛选系统在BHK-DR细胞中筛选抗ZIKV药物提供了有利条件。将已报道的具有抗ZIKV的药物ribavirin、chloroquine和6-Azauridine利用报告型ZIKV-GFP病毒进行验证，实验结果与其报道一致，表明所拯救的报告型ZIKV-GFP病毒系统可以用于抗病毒药物筛选。本研究进一步利用报告型报告型ZIKV-GFP病毒系统对一种包含974种来源于植物的药物库进行筛选，经过初步筛选，进一步验证筛选，结果发现编号为:2X7、2X11、6X6、12X3、11X9的五种药物对ZIKV具有很好的抑制效果。 综上所述，本研究成功制备了ZIKV C、prM和E蛋白多克隆抗体，为进一步开展ZIKV研究工作提供了基础。成功构建了ZIKV反向遗传操作平台，拯救了巴西流行株ZIKV以及表达GFP的报告型病毒，为进一步开展病毒的致病机制研究，开发疫苗研究等提供基础。建立了抗病毒药物筛选平台，初步筛选出了在细胞水平具有抗ZIKV活性的天然植物来源的5种药物。本研究为进一步开展ZIKV防控研究工作提供了重要基础。