利用农杆菌通过花器浸蘸法转化小麦的研究

摘要

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)已被广泛用于双子叶植物遗传转化,但是却比较难以转化单子叶植物特别是具有重要经济值的小麦、玉米和水稻等.农杆菌介导拟南芥转化的花器浸蘸法(floral dip)是当前不需要组织培养或植株再生的最简单的转化方法.我们将该方法应用于小麦的转化,通过GUS报告基因系统详细的探讨了影响GUS瞬时表达频率的因素,并有分子证据表明外源基因已经整合进小麦的基因组中,初步建立了通过花器浸蘸法利用农杆菌转化小麦的体系.在该研究中,农杆菌菌株LBA4404(pTOK233)有徕对处于花期的小麦穗部进行浸蘸处理,其含有一超双元载体pTOK233,在其T-DNA区携带有gus报告基因和潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),我们在不同处理条件下对小麦花器的GUS瞬时表达频率进行了研究,并根据GUS的瞬时表达频率确立了适宜的接种条件.结果表明,适宜的接种时期应在小麦开花前2天至刚见花;接种菌液的OD600值应0.75至0.9之间;接种菌液的PH值应在5.8左右;浸蘸时间以5分钟为宜;保湿时间以24小时较为合适.在供试的七个品种中均检测到了较高的GUS瞬时表达频率.该研究证明了利用农杆菌通过花器浸蘸法能够转化小麦.

目录

文摘

英文文摘

缩略词

前言

一植物基因转化研究概况

1植物基因转化的受体系统

2转化载体

3基因转移系统

二农杆菌介导植物遗传转化的机理

1农杆菌的趋化性和对植物伤口组织的附着

2 vir基因的诱导

3 T-DNA的加工及其T-复合体的跨膜转移

4 T-DNA的整合及在植物中的表达

三农杆菌介导基因转化的方法

1原生质体共培养转化法

2叶盘转化法

3整体植株接种共感染法

4植株直接转化法

四农杆菌介导的单子叶植物基因转化研究

五小麦基因转化研究进展

六小麦基因转化中存在的问题

七本课题的研究目的和意义

材料和方法

一材料

1小麦材料

2根癌农杆菌菌株

3生化试剂

4主要实验仪器

5培养基

6大肠杆菌质粒DNA提取用试剂

7植物总DNA提取用试剂

8点杂交用试剂

二方法

1小麦受体材料的准备

2农杆菌菌株的培养及保存

3花器浸蘸法接种

4小麦花器及胚的GUS组织学检测

5小麦胚的愈伤组织诱导及带菌检测

6小麦T0代植株的抗生素抗性筛选及其GUS组织学检测

7大肠杆菌菌株MT607(pTOK233)的构建及鉴定

8转基因植株的检测

结果与分析

一影响GUS瞬时表达频率的因素

1小麦花期的不同阶段对GUS瞬时表达频率的影响

2接种菌液浓度对GUS瞬时表达频率的影响

3 pH值对GUS瞬时表达频率的影响

4浸蘸时间对GUS瞬时表达频率的影响

5保湿时间对GUS瞬时表达频率的影响

6浸蘸次数对GUS瞬时表达频率的影响

7小麦穗的不同部分的GUS瞬时表达频率

8不同品种的GUS瞬时表达频率

二小麦胚的GUS组织学检测及愈伤组织诱导

三转化体的潮霉素筛选和GUS组织学检测

1潮霉素筛选浓度的确定

2筛选结果

3小麦整体植株GUS组织学染色

四转化体的PCR检测和Southern点杂交鉴定

1大肠杆菌菌MT607(pTOK233)的构建及质粒的酶切鉴定

2转化体的PCR检测

3转化体的Southern点杂交鉴定

讨论和结论

一讨论

二结论

参考文献

致谢