海南根瘤菌I66结瘤基因nodD的克隆及其功能检测

摘要

海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)I66分离自中国海南海.以I66的总DNA为模板,再以该引物进行PCR扩增,得到约700bp的片段,证明所得片段为I66 nod D基因的一部分.用Sac I完全酶切I66的总DNA后,得到6个阳性克隆,选取其一命名为pUCTD,测定结果显示为,I66 nod D基因与S.meliloti nod D基因高度同源.回收SacI酶切后2.2kb大小的插入片段,将其连接到具有广泛寄主的载体pBBR1MCS-5上,筛选转化子,经酶切验证,得到pUCTD-1.三亲本杂交把质粒pUCTD-1转入豌豆根瘤菌蚕豆生物型LPR5045中进行黄酮诱导试验,结果,所得的接合子能在含有毛地黄黄酮的FY平板上呈现蓝色,说明I6的nodD基因能接受苜蓿分泌的毛地黄黄酮的诱导,激活其他结瘤基因的转录,其NodD蛋白具有结瘤调节的功能.

目录

文摘

英文文摘

第一部分 文献综述

一、根瘤菌与豆科植物的共生关系

二、结瘤基因的结构和功能

三、结瘤因子

四、结瘤基因的转录调控

研究思路与预期目标

第二部分：材料与方法

一、材料

1.菌株与质粒

2.缓冲液、试剂及培养基

二、方法

1.I66的总DNA的提取

2.对提取的总DNA样品的要求

3.总DNA酶切电泳

4.质粒的提取

5.I66 nod D探针的制备

6.DNA探针的标记

7.标记探针的检测

8.DNA的酶切

9.琼脂糖凝胶电泳

10.DNA片段的回收及纯化

11.DNA片段的体外连接

12.感受态细胞的制备

13.细胞的转化

14.含有转化质粒的细菌菌落的筛选和鉴定

15.三亲本杂交

16.Southern杂交

17.类黄酮诱导的颜色反应

第三部分 结果和分析

1.I66的总DNA的提取

2.I66的nod D探针的制备

3.nod D基因的部分基因文库的构建

4.I66 nodD阳性克隆的分析

5.I66 nodD基因的测序及序列分析

6.I66 NodD蛋白的功能检测

7.结论

参考文献

致谢