ABA调节基因启动子的表达活性分析及PKA催化亚基的克隆、功能分析

摘要

脱落酸（abscisic acid,ABA）是上个世纪六十年代鉴定出的一种天然存在的植物激素.它可能存在于所有高等植物中,参与调控许多重要的生理过程,如：气孔的关闭,胚胎发育,种子休眠与萌发以及叶片的脱落等.研究发现它都是通过调节一系列基因的表达来实现这些生理活动的.目前人们已经克隆并分析了许多受ABA诱导的基因（Em,rd29,rd22,rdb18等）和它们的启动子,其中rd29基因的表达既受ABA的诱导,也受干旱和盐胁迫的诱导.进一步分析它的启动子（rd29A）发现其含有ABA响应的核心元件G-box和干旱响应元件（DRE）,其中DRE是不依赖于ABA的顺式作用元件（Manabu,1997;Yamaguchi-Shinozaki,1994）.根据现在的研究成果,基本上能够勾画ABA信号转递途径的粗略框架,但许多环节还只是设想和推测,尚需要进一步研究证实.ABA信号转导途径是否涉及到cAMP信号系统以及与ABA诱导基因相关的转录因子与顺式作用元件的互作等都是亟待解决的问题.

目录

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第一部分文献综述

第一章ABA信号转导的研究进展

一脱落酸(ABA)生理功能

1 ABA调节植物对水分胁迫的响应

2 ABA对气孔保卫细胞的作用

3对种子休眠的调节作用

4其它的生物功能

二ABA生物合成途径及其突变体

1 ABA生物合成

2 ABA生物合成途径

3 ABA生物合成缺陷型突变体

4 ABA反应敏感性突变体

三脱落酸(ABA)信号转导

1 ABA结合蛋白(ABA-BP)

2与ABA相关的信使

3 ABA调节的基因表达

第二章cAMP信使系统的研究进展

一前言

二cAMP信号传递模型

三cAMP信使系统的组分

1腺苷酸环化酶(AC)

2 cAMP的灭活

3 cAMP下游效应物

四植物细胞中cAMP信使途径的研究进展

1植物细胞中cAMP存在的直接和间接证据

2 AC、PDE存在的实验证据

3 PKA存在的实验证据

4植物细胞中cAMP的生理功能

五本研究的目的和意义

第二部分研究报告

第三章：转rd29A-GUS烟草悬浮细胞系的获得

一前言

二材料与方法

1材料

2试剂配制

三结果与分析

1植物表达载体的构建

2植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404

3转化烟草

4转基因烟草的分子检测

5 GUS表达的组织化学定位

6愈伤组织诱导及悬浮细胞培养

7悬浮细胞PCR检测

8 ABA诱导表达的GUS活性测定

四讨论

第四章：rd29A-GUS基因表达的活性调节

一前言

二材料与方法

1材料

2方法

三结果与分析

1钙离子对GUS活性的影响

2 G蛋白是否参与烟草悬浮细胞的ABA信号转导

3 cAMP参与ABA信号转导

4 cADPR参与ABA信号转导及其与cAMP关系

5 H2O2对ABA信号的调节作用

四讨论

第五章：拟南芥PKA催化亚基的克隆、活性测定及其功能的研究

一前言

二材料与方法

1材料

2试剂配制

3实验方法

三实验结果与分析

1利用BLAST2.0分析拟南芥基因组

2通过RT-PCR扩增拟南芥PKA催化亚基

3同源性分析

4原核表达载体的构建

5外源基因的诱导表达

6表达产物的纯化

7蛋白激酶活性分析

8抗血清效价的测定

9 Western-blot鉴定

10 Northern-blot分析

四讨论

第六章：转录因子abi 3与ABA信号转导途径的关系

一前言

二材料与方法

1材料

2技术路线

3实验方法

三结果与分析

1农杆菌GV3101中植物表达载体的鉴定

2转基因拟南芥T0代筛选

3植物组织的直接PCR

4转基因拟南芥的Southern-blot鉴定

5 GUS表达的组织化学定位

6 GUS表达的活性分析

7 Northern-blot分析

8 Pabi3-GUS的诱导分析

四讨论

结论

参考文献

致谢