鸡传染性法氏囊病病毒非编码区结构和5′非编码区缺失病毒突变体构建及其诱导细胞凋亡的研究

摘要

为了研究超强毒株毒力增强的原因是否与非编码区有关,在基因特异性的上游引物引入T7 RNA聚合酶启动子序列和EcoRI酶切位点,下游引物引入XbaI（A节段）和BamHI(B节段）酶切位点,采用双融合PCR方法将超强毒株的非编码区和编码区正确拼接,并分别克隆到pUC18质粒的相应位点上.通过酶切和末端序列分析鉴定重组质粒,获得了全基因组cDNA克隆pUC18-HA和pUC18-HB,并以此为基础构建了3个A节段5′非编码区缺失的突变体pUC18-HAΔ35、pUC18-HAΔ74、pUC18-HAΔ94和1个嵌合体pUC18-C5′/HA的侵染性克隆.为进一步通过反转录遗传体系来研究5′非编码区对病毒复制和细胞凋亡的影响奠定了基础.将超强毒株Harbin-1A节段及其5′非编码区缺失突变体和嵌合体cDNA克隆用XbaI线性化,B节段cDNA克隆用SmaI线性化,进行体外转录,分别获得了各自的cRNA.A节段及其5′非编码区缺失突变体和嵌合体的cDNA分别与B节段cDNA共转染法氏囊原代细胞和Vero细胞,2天后收毒.转染上清经4次传代,用免疫荧光法检测病毒抗原,结果在法氏囊原代细胞上检测到了重组病毒（rIBDV）,而在Vero细胞上未能检测到病毒抗原.以重组病毒为材料进行病毒诱导细胞凋亡的研究,以荧光染色和流式细胞仪检测,发现重组病毒均能诱导法氏囊原代细胞发生凋亡,但不同的病毒诱导细胞凋亡的能力不同.5′非编码区缺失病毒诱导的细胞凋亡率明显低于野生型病毒,5′NCR的突变可能是影响RNA的稳定性、RNA的复制和病毒蛋白表达的速度,从而影响其诱导细胞凋亡的能力.该实验结果显示,IBDV的非编码区不是病毒复制所必需的.此研究为重组IBDV疫苗的研究提供理论依据.

目录

摘要

Abstract

Abbreviation

第一部分文献综述

(一)传染性法氏囊病病原简介

(二)病毒结构与基因组

(三)病毒蛋白及其功能

(四)病毒的复制与调控

(五)抗原性和毒力变异的分子基础

(六)IBDV的免疫抑制与细胞凋亡

(七)IBDV侵染性克隆的研究

(八)IBDV的预防与抗原基因免疫

(九)我国的研究简况及本论文的研究目的

第二部分两株不同毒力的IBDV毒株基因组非编码区的克隆与分析

1.立题意义

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

第三部分IBDV 5'非编码区缺失病毒突变体及嵌合体侵染性克隆的构建

1.立题意义

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

第四部分IBDV重组及其诱导细胞凋亡的研究

1.立题意义

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

总结

参考文献

致谢