马铃薯（Solanum berthaultii）中花粉特异表达基因SB401功能研究

摘要

SB401基因是一个编码高赖氨酸蛋白的马铃薯(Solanum berthaultii)花粉特异表达基因,我们构建了在CaMV 35S启动子驱动下的SB401基因的正义表达、反义RNA和RNAi载体,导入马铃薯,利用超量表达、异位表达、反义阻断以及RNA干扰效应改变植物内源SB401基因的表达;通过对转基因植株花和花药表型的分析,探讨SB401基因在马铃薯花粉发育过程中的确切功能作用.该实验中,我们构建了正义、反义表达载体和RNA干扰载体,优化了马铃薯遗传转化体系;通过农杆菌转化,我们将这三种载体导入马铃薯中,分别获得了超表达、反义抑制、RNA干扰和转基因植株,得到了反义和RNA干扰转基因植株的花和花药;PCR和Southern检测证明外源T-DNA已插入植物基因组中;叶片组织的Northern杂交显示SB401基因可以在正义表达转基因植株叶片组织中转录,在部分反义表达转基因植株中有反义转录本的存在,而在RNA干扰转基因植株中未检测到;分别取对照、反义表达和RNA干扰转基因马铃薯成熟花药中的花粉,分析其内源SB401 mRNA和蛋白质的抑制情况,半定量RT-PCR和western blot检测表明在部分的转基因植株中内源SB401 mRNA的蛋白质的转录和表达被阻抑了,western blot的结果显示在被抑制的转基因植株中内源蛋白的抑制程度不同.而这种抑制呈一个梯度效应,即有的植株中目的蛋白抑制程度较高、有的中等、有的较弱.两个正义表达转基因植株5和17均有外源蛋白在叶片组织中表达.在扫描电镜视野中,对照非转基因植株成熟花粉粒形态饱满,大小均一;而反义表达和RNA干扰转基因植株形态异常的花粉粒皱缩扁瘪,严重凹陷,基本不含内容物;这两种转基因植株在小孢子发育前、中期,花粉壁完整,有细胞核,中间有大量液泡;而在随后的时期中,发现小孢子停止了发育,细胞质发生严重地收缩,紧靠在花粉壁边,最后只留下抗分解的花粉壁残骸,局部放大的照片显示,此时细胞发生严重地收缩,紧靠在花粉壁边,最后只留下抗分解的花粉壁残骸,局部放大的照片显示,此时细胞质中细胞器结构已模糊不清,细胞内膜系统被破坏.由于SB401基因是一个花粉特异表达的晚期基因,在有丝分裂之后才大量表达;由此我们认为在反义和RNA干扰转基因植株的花粉发育中,缺失该基因的功能将使小孢子形态和内部结构发生明显异常,最终不能发育成正常双核成熟花粉.转基因反义和RNA干扰植株花的形态发生变化,有的雄蕊数目发生了变化,增加到6-8个,而且雄蕊外形上不饱满、发生了弯曲,长度变短,有的发生雄蕊花瓣化和重瓣的现象;正义转基因株系在进入生殖生长期后,与对照和反义表达及RNA干扰转基因植株相比,表现为发育缓慢,只有部分很小的几毫米长度的花蕾出现,并且花蕾的发育速度也很缓慢,我们在实验中没有得到转基因植株的花和花药.

目录

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缩略语

一文献综述

1.1 RNA干扰的研究进展

1.2反义RNA技术

1.3植物雄性不育的研究进展

1.4本课题研究的目的和意义

二材料与方法

2.1实验材料

2.2常用培养基和溶液的配制

2.3基本实验方法

三表达载体的构建、农杆菌法转化和转基因马铃薯的分子检测

3.1正义、反义RNA和RNA干扰载体的构建

3.2农杆菌法转化马铃薯

3.3马铃薯抗性植株开花

3.4转基因马铃薯植株PCR、Southern杂交和Northern杂交的检测

3.5反义和RNA干扰转基因马铃署花药中内源SB401mRNA和蛋白被阴抑的情况分析

3.6小结

四转基因马铃薯SB401基因功能的研究

4.1反义和RNA干扰转基因马铃署花粉形态和活力的观察分析

4.2反义和RNA干扰转基因马铃薯花药发育的组织学观察分析

4.3对正义、反义和RNA干扰转基因马铃薯植株的形态学观察及分析

五讨论

结论

参考文献

致谢