同源序列高剂量异常表达及病毒编码蛋白对基因沉默的作用

摘要

RNA沉默是生物体中普遍存在的一种由同源序列引起的RNA降解过程,病毒或转座子入侵、以及体内产生的各种异常结构RNA都可能成为诱导RNA沉默发生的因素.为了认识同源性RNA的结构形式和表达剂量对诱发植物基因沉默的影响,以及某些植物病毒编码蛋白对基因沉默的抑制作用,为深入了解植物基因沉默的机制提供更多的资料,该论文就以下内容开展了研究.分别以低拷贝(pBIN19)和单拷贝(pMW75515J)的双元载体为骨架,构建了NOS终止子缺失的GFP基因(GFP-ΔTnos)表达载体.采用农杆菌浸润法(agro-infiltration)感染转基因本生烟16C,并对同源基因瞬时表达所引起的植物表型变化、小分子RNA的产生、DNA甲基化程度、以及相关性状在后代中的遗传情况进行了检查.根据发生沉默的时间早晚、发生沉默的植株比例以及程度的观察,发现GFP-ΔTnos载体诱发同源基因沉默的效率明显高于含有完整表达单元的同类载体;低拷贝载体诱发同源基因沉默的效率明显高于含有相同表达单元的单拷贝载体.在发生沉默的植株体内,在GFP蛋白及RNA被不同程度降解的同时,可以检测到21-26nt的小分子RNA(siRNA),同时GFP基因编码区也受到显著地甲基化修饰.这种转录后基因沉默(PTGS)现象可以在植株体内系统传播,但不能遗传给后代.接种野生型本生烟后的RT-PCR结果表明,GFP-ΔTnos载体瞬时表达所产生的GFP RNA可能没有poly(A)尾序.以上结果表明,同源性基因表达产物的结构形式及其在植物体内的表达剂量是影响PTGS能否发生以及发生程度的两种互相关联的关键因素.获得了含有GFP-ΔTnos表达载体的转基因本生烟,在部分转基因株系中GFP基因的表达受到抑制.Northern分析显示:GFP-ΔTnos载体所表达的GFP基因产物多数滞留在细胞核内部,不能被运送到细胞质中.筛选含有单个GFP基因(GFP1)或3个串联重复GFP基因(GFP3)的转基因烟草,获得荧光表型基本一致的纯合株系.用含有GFP基因的PVX病毒载体(PVX-GFP)接种后,GFP3株系对PVX-GFP侵染的抵抗能力明显高于GFP1株系.分子检测结果显示,GFP3植株中普遍存在GFP基因的沉默现象,且GFP DNA的甲基化程度明显高于GFP1植株,说明这些植株对于病毒的抗性与目的基因的插入位点及拷贝数和无关,但与串联重复的GFP基因结构形式密切相关.将RBSDV S6基因组分和BNYVV RNA2的14kD蛋白基因分别插入经改造的PVX病毒载体,与正常的GFP表达载体共侵染本生烟.表型观察和分子检测表明,S6和14kD基因可以对GFP基因的沉默产生不同程度地抑制作用,且S6对同源基因DNA的甲基化具有抑制功能.S6和14kD都能够逆转由GFP-ΔTnos载体引起的GFP基因沉默,其中S6基因的能力较强.同时,研究了RBSDV其他一些基因组成分对基因沉默的影响,发现编码两个蛋白的S7组分,以及S8组分对GFP基因沉默抑制效果较为明显.

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1 RNA沉默——生物中普遍存在的表达监控机制

1.1.1 RNA沉默的概况

1.1.2 RNA沉默的过程

1.1.3 RNA沉默的机理

1.1.4 RNA沉默中的关键因子及相应作用

1.1.5 RNA沉默的生物学意义及实际应用

1.2 RNA监控机制(RNA surveillance)

1.2.1 RNA surveillance系统的定义及分类

1.2.2 RNA surveillance系统的特点及过程特征

1.2.3 RNA surveillance系统与正常mRNA降解有着不同的分子机制

1.3真核生物mRNA3′非翻译区的组成及对基因表达的影响

1.3.1 mRNA 3′-UTR内的末端加工信号

1.3.2 mRNA 3′-UTR加工的复杂性

1.3.3 mRNA 3′-UTR对基因表达的影响

1.4 RNA沉默丰富了病毒与宿主植物之间的互作与共进化关系

1.4.1基因沉默——植物抵御外来病毒入侵的一种机制

1.4.2病毒对植物的反应

1.5本研究的目的和意义

第二章实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1宿主菌

2.1.2质粒载体

2.1.3各种酶及试剂

2.1.4植物材料

2.1.5病毒基因及侵染性克隆

2.1.6所用引物

2.2常用培养基和溶液的配制

2.2.1培养基配制

2.2.2常用溶液的配制

2.2.3实验所需试剂及其配制

2.3基本实验方法

2.3.1大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3.2大肠杆菌感受态细胞的转化

2.3.3重组质粒的快速鉴定(Cracking)

2.3.4碱裂解法少量提取质粒DNA

2.3.5碱裂解法大量提取质粒DNA

2.3.6 DNA片段的回收

2.3.7在质粒载体中进行DNA克隆

2.3.8 Agro-infiltration方法接种本生烟

2.3.9植物组织基因组DNA的提取

2.3.10 Southern杂交

2.3.11植物组织总RNA的提取

2.3.12低分子量RNA的提取

2.3.13 Northern杂交

2.3.14 RT-PCR-Southern

2.3.15 Western Blot

2.3.16本生烟(Ncotiana benthamiana)的遗传转化

2.3.17细胞核RNA与细胞质RNA的提取

2.3.18本生烟原生质体的电击转化

2.3.19植物基因沉默的观察记录

2.3.20转基因植株后代的Kan抗性筛选

2.3.21转基因植株的ELISA检测

第三章异常mRNA表达在植物基因沉默中的作用

3.1载体的来源与结构

3.2注射侵染后表型的观察与统计

3.3表型变化后的分子检测

3.3.1 Northern Blot

3.3.2沉默植株中的siRNA检测

3.3.3接种本生烟体内正、负意GFP siRNA的积累情况检测

3.3.4接种本生烟中的GFP基因的甲基化分析

3.4沉默植株的嫁接试验

3.5讨论

第四章同源序列诱发系统性基因沉默的剂量效应

4.1供试的表达载体

4.2不同类型载体接种后诱发基因沉默的效率比较

4.3接种植株体内GFPmRNA的Northern blot检测

4.4接种植株内siRNA的检测

4.5接种植株基因组DNA甲基化的检测

4.6接种植株体内瞬时表达的GFP蛋白Western Blot检测

4.7通用表达载体的构建

4.8讨论

第五章异常结构GFP基因表达产物的特性分析

5.1 GFP基因异常表达载体对本生烟的遗传转化

5.1.1本生烟再生植株的获得

5.1.2再生植株的统计及长波紫外下的表型观察

5.1.3再生植株的分子检测

5.2 GFP基因异常表达产物的特性分析

5.2.1转录物的结构形式

5.2.2转录物的细胞定位

5.3讨论

第六章重复串联基因结构诱发的基因沉默与植物病毒抗性

6.1供试转基因烟草

6.2转基因纯合系的筛选鉴定

6.2.1 Kan抗性的纯合系的筛选

6.2.2纯合表型株系的鉴定

6.3抗性植株的分子检测

6.3.1 Northern检测表明了转化不同结构的植株GFP基因沉默的程度不同

6.3.2转基因烟草的Southern Blot检测

6.3.3转基因植株中GFP基因的序列测定

6.3.4不同表型转基因植株的DNA甲基化检测

6.4 GFP3转基因植株的嫁接试验

6.5 GFP1和GFP3株系的抗病性测定

6.5.1 T1代植株的抗病性检测

6.5.2 T3代植株的抗病性检测

6.6结果与讨论

第七章BNYVV和RBSDV编码基因沉默抑制子的初步研究

7.1嵌合载体的构建

7.1.1 PVX载体ND108的改造构建

7.1.2表达外源病毒基因的PVX嵌合载体构建

7.2病毒基因嵌合载体接种本生烟后的症状表现与Northern检测

7.3 BNYVV-14K和RBSDV-S6对本生烟16C基因沉默的抑制

7.3.1嵌合病毒载体对基因沉默的逆转作用

7.3.2对双元载体pinG引发基因沉默的抑制作用

7.4 RBSDV不同基因组分对PVX症状及GFP瞬时表达的影响

7.4.1嵌合载体混合接种后的症状表现与病毒检测

7.4.2嵌合载体混合接种后GFP基因的瞬时表达情况

7.5讨论

结论

参考文献

缩略词

致 谢