人工改造的cry1Ac、cry1Ie基因在大肠杆菌、转基因烟草和玉米中的表达

摘要

该研究根据植物所偏爱密码子原则,改造苏云金芽孢杆菌cry1Ac,cry1Ie野生型基因的编码区序列,人工合成cry1Ac,cry1Ie基因.将这两个基因构建到原核表达载体pET28b中,构建成原核表达载体pETAc和pETIe.将两个原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行了诱导表达.诱导表达出两个目的蛋白并进行了纯化.纯化的目的蛋白免疫兔子,制备了这两种蛋白的多克隆抗体.纯化这两种蛋白的包涵体,用玉米螟进行虫试.虫试结果显示原核表达的两种包涵体蛋白对玉米螟有较好的杀虫活性.进一步将cry1Ac,cry1Ie基因构建到真核表达载体p3301中,构建植物表达载体p3301ubiAc和p3301ubiIe.在这两个表达载体中,两个基因分别受ubiquitin启动子的调控.两个载体转化烟草并得到了转基因烟草,PCR、Southern杂交结果显示,cry1Ac,cry1Ie基因整合到转基因烟草的基因组中.用转基因烟草叶片进行虫试,结果显示转基因烟草能有效杀死玉米螟幼虫.运用PCR技术克隆了马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ的信号肽序列,并将其分别连到cry1Ac,gfp基因的5'端,构建植物转化载体p3301ubisigAc和p3301ubisigGFP.分别用这两个载体转化烟草,并得到转基因植株.荧光显微观察到GFP在植物细胞间隙高效表达,Western blot结果显示Cry1Ac蛋白也在植物细胞间隙表达.这些结果表明,马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ的信号肽序列能将外源蛋白定位到植物细胞间隙.ELISA结果显示,马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ的信号肽序列使cry1Ac基因在转基因烟草中的表达量显著提高.通过PCR方法,克隆了玉米叶绿素a/b结合蛋白基因的启动子(cab启动子)和玉米伸展蛋白基因的启动子(silk启动子).将此两个启动子、玉米ubiquitin启动子与cry1Ie,cry1Ac基因分别构建成表达载体p3301cabIeubiAc,p3301silkIe和p3301ubiAc.转化玉米得到转基因玉米植株.转基因玉米田间和温室玉米螟接虫鉴定结果表明,有些转基因玉米株系具有较好的抗虫性.

目录

文摘

英文文摘

缩略词

第一章文献综述

一转Bt基因植物研究进展

1 Bt杀虫蛋白基因

2 Bt转基因植物研究

3昆虫对Bt转基因植物产生抗性问题及预防对策

4 Bt转基因植物安全性问题

二使外源基因在转基因植物中高效表达的方法与策略

三本论文研究的目的意义

第二章cry1Ac、cry1Ie基因的改造及在大肠杆菌中的表达

一材料与方法

二结果与分析

1基因改造

2原核表达载体pETAc、pETIe的构建

3 Cry1Ac、Cry1Ie蛋白在E.coli中的表达

4蛋白纯化及抗体制备

5抗血清的制备和效价测定

6原核表达虫试结果

第三章cry1Ac、cry1Ie基因在转基因烟草中的表达

一材料与方法

二结果与分析

1载体构建

2植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404

3根癌农杆菌介导的烟草转化

4转基因烟草的PCR鉴定

5转基因烟草的Southern blot鉴定

6转基因烟草的金标试纸条检测

7转基因烟草虫试

第四章马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ信号肽序列使Cry1Ac蛋白定位高效表达

一材料与方法

二结果与分析

1马铃薯蛋白酶抑制剂基因Ⅱ信号肽序列(pinⅡ)的PCR扩增

2 GFP的PCR扩增

3载体构建

4根癌农杆菌介导的烟草转化

5转基因烟草的PCR鉴定

6gfp基因在转基因烟草中表达的荧光显微镜观察

7转基因烟草的Western检测

8转基因烟草的ELISA检测

第五章cry1Ac、cry1Ie基因在转基因玉米中的表达

一材料与方法

二结果与分析

1 silk启动子、cab启动子的PCR扩增

2载体构建

3农杆菌介导的玉米转化

4再生植株的分子检测

5转基因植株后代在田间、温室中的抗虫性鉴定

6转基因植株后代的Western blot

第六章讨论与结论

参考文献

致谢