病毒基因介导的抗性机制及抗病毒转基因西瓜的研究

摘要

为了探讨不同转基因结构形式对诱发植物基因沉默,以及在病原介导抗病性中的作用,构建了五种不同结构形式的烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白(CP)基因植物表达载体:pS18、pR29、pDS24、pⅡ38和pⅢ19,借助于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404)将它们转入烟草(Nicotianatabaccum cv.NC89).经过Southern-blot检测,证明五种载体均成功地转入了烟草植株,转化率约在37-59﹪之间,插入拷贝数1到6个不等.T0代的RT-PCR显示,除载体pDS24转基因植株中的外源基因没有按照预期的那样转录产生反义RNA以外,其它基因结构形式均得到了正常转录.5种基因结构形式的T2代转基因植株的抗病试验证明,到开花期为止仍有部分植株不表现病状,而且载体pⅡ38、pⅢ19转基因植株的发病率低于其它结构形式的转基因植株.这说明,外源基因的直接重复序列所介导的抗病性水平较其它结构形式更高.对T2、T3代转基因植株的甲基化分析显示,与重复序列相比,外源基因的插入拷贝数与其甲基化关系更密切,甲基化程度也和植株的抗性有一定的正相关.至于外源基因直接重复对转录后基因沉默水平的影响,Northern-blot结果显示,相对于含有2个基因直接重复序列的转基因植株,由3个相同基因构成的直接重复序列的外源基因更容易形成转录后基因沉默.针对目前中国西瓜生产种植中的病毒病危害,为了培育抗多种病毒的转基因西瓜,我们构建了同时含有西瓜花叶病毒(WMV)外壳蛋白(CP)基因、西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)复制酶(NIb)基因和黄瓜花叶病毒(CMV)复制酶基因的三价植物表达载体pBWCZ-44,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(pAL4404)介导转化西瓜子叶外植体,获得再生植株.经PCR和Southern-blot检测,证明目的基因成功地导入西瓜植株,并能够在后代植株中遗传,最终转化效率约为1.7‰.分别在温室和大田中对T2、T3代转基因株系进行的病毒接种试验和抗病性筛选鉴定结果表明,所得到的转基因西瓜株系分别表现出感病、免疫和症状恢复等不同的类型.其中对T3代植株的检测表明,转基因株系BH1-7对ZYMV和WMV的抗病能力普遍达到中等水平以上,并保持了受体西瓜品系原有的优良农艺性状,为抗病毒西瓜新品系的获得奠定了基础.

目录

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摘要

Abstract

第一章病毒基因介导的转基因植株抗性机制的研究进展

1蛋白水平的抗性

1.1外壳蛋白介导的抗性

1.2复制酶介导的抗性

1.3运动蛋白介导的抗性

2 RNA水平的抗性

2.1 RNA阈值模型(RNAthreshold model)

2.2异常RNA模式

2.3 RNAi模型/dsRNA模型

2.4外源基因的甲基化

2.5外源基因的插入位置

第二章不同结构形式烟草花叶病毒外壳蛋白基因介导的抗性机制

1研究目的与意义

2实验材料

2.1质粒载体

2.2各种酶及试剂

2.3植物材料

2.4毒源

2.5抗体

2.5寡核苷酸引物

3实验方法

3.1植物表达载体的构建

3.2烟草的转化

3.3一步法小量提取植物总RNA和总DNA

3.4基因组DNA的PCR扩增

3.5转基因植株的RT-PCR检测

3.6植物基因组DNA的大量提取

3.7放射性探针的制备——随机引物法标记探针

3.8 Southern杂交

3.9植物组织总RNA的提取

3.10 Northern杂交

3.11转基因植株的Western-blot检测

3.12转基因植株后代的Kan抗性筛选

3.13转基因植株的抗病性检测

3.14转基因植株的siRNA的提取

3.15 siRNA的Northern-blot

4结果与分析

4.1转基因植株PCR检测

4.2转基因植株的RT-PCR检测

4.3转基因植株的Southern-blot检测

4.4转基因植株的Northern-blot检测

4.5转基因植株的Western-blot检测

4.6转基因植株的siRNA检测

4.7 Kan筛选试验

4.8转基因烟草植株的攻毒试验及抗性分析

4.9外源基因的甲基化分析

5讨论

第三章抗病毒转基因西瓜的选育

1研究背景及试验的目的与意义

2实验材料

2.1质粒载体

2.2植物材料

2.3毒源

2.4抗体

2.5寡核苷酸引物

3实验方法

3.1农杆菌转化

3.2农杆菌菌液的准备

3.3西瓜外植体的培养与遗传转化

3.4转基因西瓜植株的抗病性检测

4结果与分析

4.1西瓜外植体的转化

4.2转基因植株的PCR检测

4.3外源基因的Dot-blot和Southern-blot检测

4.4转基因后代植株的抗病性鉴定

5讨论

结论

参考文献

缩略词(Abbreviation)

致谢

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