牛免疫球蛋白lambda轻链恒定区序列的克隆与研究

摘要

本研究的主要目的是获得关于牛免疫球蛋白lambda轻链恒定区的序列，为获得敲除免疫球蛋白基因的转基因牛打下基础。通过筛选牛基因组DNA文库，获得含有牛免疫球蛋白lambda轻链的阳性克隆，进而获得免疫球蛋白lambda轻链C区的序列，主要工作包括：　　1、以牛lambda轻链Cλ区保守序列为探针，利用PCR与原位杂交的方法，从牛λ噬菌体基因组文库中筛选得到两个含有牛免疫球蛋白lambda轻链Cλ区的阳性克隆，酶切分析表明他们分别含有大小为7kb和9kb的外源片段。采用PCR筛选系统，从牛的BAC基因组文库中筛选得到一个含有牛免疫球蛋白lambda轻链C区的阳性克隆。酶切后的脉冲电泳(PFGE)结果表明其插入片度长度为130kb左右。　　2、为研究lambda轻链Cλ的数量和Igλ的结构，将得到的BAC阳性克隆用不同限制性内切酶酶切，然后与408bp的Cλ区特异性探针杂交，SouthernBlot杂交结果显示有7条阳性条带。这一结果表明牛免疫球蛋白lambda轻链至少含有7个Cλ区，跨越了轻链大小约40kb的范围。　　3、将筛选得到的λ噬菌体阳性菌斑和BAC阳性克隆酶切后的阳性条带分别回收，连接于克隆载体pGEM-3zf(+)上，得到5个重组质粒，含有Cλ的插入片段的长度分别为2660bp，1682bp，2514bp，1860bp和1806bp。　　4、利用获得的五个阳性克隆片段的序列，设计六对不同的引物进行PCR扩增，分析扩增产物彼此间的关系，结果表明阳性片段S3，S2和S4依次相邻，分布在牛lambda轻链上15kb的范围内。　　5、将本研究得到牛的4个Cλ基因序列与人的7个Cλ和小鼠的4个Cλ进行同源性比较发现，牛IgCλ与小鼠IgCλ的同源性高于牛IgCλ与人IgCλ的同源性，从进化起源上看，牛与小鼠可能有更近的亲缘关系。

目录

文摘

英文文摘

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第一章文献综述

1.免疫球蛋白的生物学特性

1.1免疫球蛋白的基本结构

1.2免疫球蛋白基因的结构

1.3免疫球蛋白基因的重排

1.4 V(D)J与C基因片段的重排和免疫球蛋白类别转换

1.5免疫球蛋白基因的表达调控

1.6免疫球蛋白多样性的产生

2.牛免疫球蛋白基因研究进展

2.1牛免疫球蛋白轻链基因

2.2牛免疫球蛋白重链基因

2.3牛抗体多样性产生的机制

3.基因工程抗体及利用转基因动物生产人源化抗体

3.1小分子抗体

3.2抗体融合蛋白

3.3鼠单抗的人源化

3.4利用转基因小鼠与牛生产人源化抗体

3.5抗体药物的临床应用

4.基因组DNA文库及常用载体

4.1噬菌体载体

4.2 BAC载本

4.3 BAC文库筛选系统

5.本实验研究的目的和意义

第二章材料与方法

1.主要试剂与仪器

1.1主要药品和酶

1.2主要仪器

2.分析软件

3.常用缓冲液与试剂的配制

4.分子生物学常用技术

5.λ噬菌体文库的筛选

5.1λ噬菌体文库筛选的技术路线

5.2λ噬菌体培养常用方法

6.BAC文库的筛选

6.1菌株、载体和文库

6.2 PCR法从BAC文库中筛选阳性克隆技术方案

6.3 BAC DNA的小量提取、酶切和脉冲电泳

7.SOUTHERN BLOT

7.1 Southern Blot所需试剂

7.2探针的标记

7.3 Southern blot步骤

第三章结果与分析

1.牛λ噬菌体基因组文库的筛选与鉴定

1.1牛基因组的提取

1.2 PCR扩增牛免疫球蛋白lambda轻链Cλ区保守序列

1.3牛λ噬菌体基因组文库的筛选

2.牛BAC基因组文库的筛选及结果

2.1牛BAC基因组文库筛选和阳性克隆的获得

2.2 BAC阳性克隆的脉冲电泳和和Southern Blot杂交

2.3阳性片段的克隆回收、连接转化及重组子的鉴定

2.4阳性重组克隆的序列测定

3.获得的牛IGλ序列之间的PCR扩增及序列分析

3.1获得的牛Igλ序列

3.2 PCR扩增及已知序列间相对位置分析

3.3牛免疫球蛋白lambda轻链Cλ序列同源性分析

3.4牛免疫球蛋白lambda轻链Cλ区序列的进化研究

第四章讨论

1.关于基因组文库的筛选

2.牛免疫球蛋白LAMBDA轻链C区的结构、大小

3.牛免疫球蛋白LAMBDA轻链的构成及其多样性的产生

结论

参考文献

致谢

附 录