原癌基因c-myc RNA干扰对细胞周期的影响

摘要

本研究用阳离子脂质体转染法首次针对c-mycmRNA的SiRNA表达质粒pSilencer-c-myc转染人肺癌细胞A549，72h后收获细胞，RT-PCR检测结果表明，干扰细胞c-mycmRNA水平降低至40％左右，WesternBlotting分析表明其蛋白水平约降低了70％，说明RNA干扰成功。　　应用流式细胞术研究c-myc表达水平降低对A549细胞周期的影响。结果表明，与对照细胞相比，RNA干扰72h后G0/G1期细胞比例由51.5±1.7％下降到35.1±1.1％，下降16个百分点，S期细胞由41.3±1.4％上升至55.1±1.6％，提高14个百分点，G2/M期则无明显差异(p＞0.05)，显示针对c-myc的RNA干扰引起S期阻滞。　　为了探明c-mycRNAi引起S期阻滞的作用途径与机制，分析了细胞周期相关基因的mRNA水平，包括cyclin、CDK和CKI。试验结果显示，干扰72h后，干扰细胞与对照细胞比较：1)细胞周期素cyclinD3、E、A的mRNA水平均出现不同程度的下降(p＜0.05)，分别下降了22±8％、30±2％和45±7％，cyclinD1则无明显变化(p＞0.05)；2)CDK2、CDK4mRNA水平下调(p＜0.05)，分别下降了44±4％、39±4％；3)细胞周期素依赖性抑制因子p21及p27的mRNA水平上升，各提高了36±6％、44±8％。　　为了探明蛋白水平与mRNA水平的对应关系，运用WesternBlotting，分析了Cyclin及CDK的蛋白水平。结果表明干扰72h后，干扰细胞与对照细胞比较，CyclinD3、E、A，CDK2、4等的mRNA下调直接导致其蛋白水平的下降(p＜0.05)，分别下降42±5％、41±2％、57±5％和56±9％、36±5％。CyclinD1无明显变化(p＞0.05)。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

1细胞周期与癌变

1.1细胞周期

1.2细胞周期素

1.3细胞周期素依赖性激酶

1.4细胞周期素依赖性激酶抑制因子

1.5细胞周期与癌变

2原癌基因c-myc

2.1 c-Myc的结构

2.2 c-Myc与细胞增殖

2.3 c-Myc与细胞凋亡

2.4 c-myc癌基因的转录激活功能

2.5 c-Myc的转录抑制功能

2.6 c-myc的激活与肿瘤

3 RNAi技术

3.1 RNAi介绍

3.2 RNAi研究进展

3.3 RNAi的应用

3.4 RNAi应用于c-myc基因的研究

3.5 RNAi应用于A549细胞的研究

4研究目的与意义

第二章材料与方法

1材料

1.1质粒及其宿主菌

1.2细胞

1.3主要试剂

1.4溶液配制

1.5主要仪器设备

2方法

2.1质粒DNA制备

2.2细胞准备

2.3脂质体介导质粒DNA转染细胞

2.4流式分析细胞处理

2.5 RT-PCR

2.6 SDS-PAGE与免疫印迹

第三章结果与分析

1质粒pSilencer-c-myc DNA鉴定结果

1.1完整性

1.2纯度

1.3酶切鉴定

2 RNAi对c-myc基因表达的影响

2.1 c-myc mRNA水平变化

2.2 c-myc蛋白水平变化

3 RNAi对细胞周期的影响

4 RNAi对细胞周期相关基因mRNA水平的影响

4.1 cyclin mRNA水平

4.2 CDK mRNA水平

4.3 p21及p27 mRNA水平

5 RNAi对细胞周期相关基因蛋白水平的影响

5.1细胞周期素蛋白水平

5.2细胞周期素依赖激酶蛋白水平及变化

第四章讨论

1 RNAi对c-myc基因表达的影响

2 c-myc RNAi对细胞周期的影响

3 RNAi对cyclin表达水平的影响

4 RNAi对CDK表达水平的影响

5 RNAi对p21及p27mRNA水平的影响

6小结

第五章结论与建议

1结论

2建议

参考文献

致谢