葡萄果实中ACPK1蛋白激酶的基因克隆和功能的初步鉴定

摘要

本实验以巨峰葡萄(Vitisvinifera×VitislabruscaL.cvKyoho)果实为材料，根据本实验室鉴定的脱落酸(abscisicacid,ABA)激活的钙依赖蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase，CDPK)ACPK1(ABA-stimulatedcalcium-dependentproteinkinasel,ACPK1)的测序结果设计合成简并引物，利用RT-PCR(reversetranscription-polymerasechainreaction)和RACE(rapidlyamplificationofcDNAends)技术克隆得到编码此蛋白的cDNA全长序列。cDNA全长为1714bp，在GenBank的注册号为AY394009。此核苷酸序列具有完整的开放阅读框，编码区长1491bp。经相关软件分析，ACPK1基因编码一个由496个氨基酸组成的多肽，分子量为56kDa，其氨基酸序列与马铃薯(Solanumtuberosum)，蚕豆(Viciafaba)，大豆和大豆种子(Glycinemax,Glycinemaxseed)，拟南芥(Arabidopsisthaliana)CPK12，水稻(Oryzasativa)，玉米(Zeamays)中的CDPKs分别有83％，81％，81％，77％，76％，76％的同源性。ACPK1具有N端可变域，激酶域，连接域和EF手形钙结合域的典型CDPKs的结构特征。ACPK1的氨基酸序列中包含5个豆蔻酰化位点，在213～231位氨基酸处有一跨膜结构。以α-32P标记ACPK1基因的cDNA全长为探针检测显示，ACPK1在葡萄基因组中可能有两个拷贝。 分别构建原核表达载体pGEX-4T/ACPK1L(cDNA全长载体)和pGEX-4T/ACPK1-N10(编码N端40个氨基酸的cDNA片段载体)，转化大肠杆菌DH5α菌株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-o-galactopyranoside，IPTG)诱导后产生了83kDa的ACPK1L融合蛋白和31kDa的ACPK1-N40融合蛋白。ACPK1L融合蛋白表现出依赖Ca2+的胶内自磷酸化活性、电泳迁移率的变化以及组氨酸底物磷酸化活性，W7[N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]抑制ACPK1L的自磷酸化活性和底物磷酸化活性，CaM和W5[N-(6-aminohexyl)-1-naphthalenesulfonamide]对ACPK1L的自磷酸化活性和底物磷酸化活性没有抑制作用。表明ACPK1基因编码的产物是一个有活性的CDPK。两种融合蛋白经纯化后制备抗体血清，根据酶联免疫分析(linkedimmunosorbentassay,ELISA)、抗原滴度检测(Proteindotblot)和Western-blot检测，表明制得的抗体血清对ACPK1具良好的特异性和较高的检测灵敏度。 经实验证实ACPK1在葡萄果肉和种子中特异表达，并呈现不同发育时期的表达差异。不同时期的表达差异与内源ABA浓度呈正相关。应用外源ABA温育葡萄果实圆片的实验体系证实，ABA在转录和翻译水平激活ACPK1，且激活效应具温育时间和ABA剂量的依赖性。 ACPK1基因在拟南芥中高效表达植株(ACPK1ox)较同期野生型植株高大，其种子萌发和幼苗生长对外源ABA处理呈现超敏现象。拟南芥中与ACPK1同源性较高的AtCPK11，AtCPK4基因完全敲除(T-DNA插入)突变体atcpk11-1，atcpk11-2，atcpk4-1植株较同期野生型植株矮小，种子萌发后期和幼苗生长对外源ABA处理呈现脱敏现象。这些结果初步表明ACPK1参与了植物的ABA信号转导过程，AtCPK11和AtCPK4可能是植物ABA信号通路中的新组分。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第二章葡萄果实中钙依赖蛋白激酶的基因克隆及其序列分析

第三章葡萄果实ACPK1融合蛋白酶学活性的检测及其抗体血清的制备

第四章ACPK1基因转录和表达产物对ABA的响应

第五章ACPK1基因在拟南芥中高效表达以及同源基因敲除突变体对ABA的反应

第六章结论

参考文献

致谢

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