适用于高密度发酵的产聚羟基烷酸重组大肠杆菌的构建

摘要

聚羟基烷酸脂(PHA)是一类生物可降解塑料，具有许多优良特性和很好的应用前景，近年来在医学领域和材料工程中发展很快。目前，PHA的生产主要是微生物发酵法，研究方向主要围绕新型PHA的合成、PHA生产成本的降低等方面。本实验研究的是聚羟基丁酸(PHB)。 为了提高PHB产量，降低生产成本，本室利用透明颤菌血红蛋白(vhb)与氧结合的能力构建能在高密度发酵过程中维持高溶氧的产PHB工程菌株，将编码VHb蛋白的基因在质粒上高拷贝表达和整合到染色体上(低拷贝表达)都没有达到预期效果，本实验构建VHb蛋白重组表达载体，将vhb结构基因置于tac启动子后，使VHb蛋白在IPTG的诱导表达下，构建E.coliHMS174(pDK101V)。摇瓶培养时发现，在菌体对数生长后期加入IPTG对菌体的生长影响最大，当在23h加入诱导剂时，E.coliHMS174(pDK101V)最终菌体浓度OD600达到32.4，PHB含量达到78.4％，而对照菌株E.coliHMS174(pDK101V)在不加诱导剂的情况下，最终菌体浓度OD600达到21.6，PHB含量达到70.8％。在5L发酵罐中培养时，在对数生长后期诱导VHb蛋白表达，最终工程菌菌体密度OD600达到96.4，PHB含量达到了50.2％；E.coliHMS174(pDK101V)在不加诱导剂的情况下菌体密度OD600达到120.6，PHB含量达到62.4％。 本实验利用mini-Tn5转座子随机突变E.coliHMS174，在溴化钠-溴酸钠筛选平板上筛选产酸少的突变株，通过摇瓶实验获得突变菌株E.coliT13，将含有phb操纵元和维持质粒稳定的parDE基因的质粒pTZ101转化E.coliT13，构建工程菌株E.coliT13(pTZ101)，通过发酵罐培养发现，突变株乙酸产量降低，最终菌体密度OD600达到78.6，PHB含量为52.4％，对照菌株E.coliHMS174(pTZ101)菌体密度OD600达到98.4，PHB含量达到55.8％，而突变株的产乙酸的量是对照菌株的50％，对照菌株的磷酸转乙酰酶的活性比突变株的高82.8％。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第二章透明颤菌血红蛋白(VHb)基因在高产PHB大肠杆菌工程菌中的应用

第三章高产PHB产酸突变大肠杆菌的筛选和发酵研究

第四章实验总结与展望

参考文献

致谢

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