促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞减数分裂成熟及精子功能的影响

摘要

促减数分裂甾醇(MAS)包括从人卵泡液提取的FF-MAS及源自牛睾丸的T-MAS，它们是胆固醇生物合成途径中的中间代谢物。FF-MAS由羊毛甾醇14α脱甲基酶(CYP51)催化羊毛甾醇转化而来，而T-MAS则是在甾醇△14-还原酶(△14-SR)的作用下由FF-MAS代谢产生。RS21745及RS21607为CYP51的特异性抑制剂，可通过抑制CYP51的活性而阻断MAS的产生：而AY9944-A-7则是△14-SR酶的抑制剂，它能够促进FF-MAS的累积。目前在小鼠及大鼠等小动物上关于FF-MAS的促卵母细胞减数分裂的能力及作用机制的报道存在不同的看法，而且在大动物上有关MAS研究的报道极少。本论文首次以大动物为研究对象，较系统地探究了MAS在猪卵母细胞体外成熟及精子功能中的作用及机制。研究结果如下：试验—研究了MAS对猪卵母细胞体外减数分裂恢复的作用及可能的作用机制。将采自猪卵巢表面直径为3-5mm卵泡的卵丘细胞包裹的卵母细胞(CEO)培养在含有卵泡刺激素(FSH)的NCSU37成熟培养液中并添加不同剂量的RS21745或RS21607，培养24小时后发现，RS21745及RS21607可剂量依赖性的抑制FSH诱导的卵母细胞减数分裂恢复的发生及卵丘扩展。而且RS21745对卵母细胞减数分裂恢复的抑制作用同样表现出时间依赖性。同时，本研究得到，AY9944-A-7对培养24h或44h的裸卵及培养24h的CEO的减数分裂恢复无任何影响，但却可以诱导培养44h的CEO的减数分裂的恢复。此外，为了探讨PKC是否参与了MAS诱导的猪卵母细胞减数分裂恢复，我们利用PKC的激动剂PMA及其抑制剂ChelerythrineChloride进行了试验。结果表明10-8-10-6MPMA可逆转RS21745抑制的猪卵母细胞的减数分裂恢复；并且5-10μMChelerythrineChloride可协同增强RS21745对FSH诱导的卵母细胞减数分裂的抑制作用。这些结果表明，MAS能够诱导猪卵母细胞体外减数分裂恢复的发生，而且其促进作用可能是通过PKC信号通路来调节的。 试验二就MAS诱导猪卵母细胞减数分裂成熟的机制即MAS是否为FSH诱导的卵母细胞减数分裂成熟过程中必要的信号分子进行了研究。首先利用MAS合成酶CYP51的特异性抑制剂RS21607加入到体外培养的猪CEOs培养液中发现，RS21607能够剂量及时间依赖性地抑制FSH诱导的猪卵母细胞减数分裂成熟，同时在体外培养44h后，RS21607明显抑制了FSH及EGF诱导的卵丘细胞的扩展。然而RS21607及AY9944-A-7两者对EGF诱导的卵母细胞成熟没有影响。反之，将CEOs在HX或FSH+HX培养液中分别培养16h，26h，34h及44h后，通过RT-PCR对其CYP51基因表达进行分析。结果得到FSH可上调HX抑制的猪卵丘卵母细胞复合体的CYP51基因的表达。采用同样的培养体系，我们将在含FSH+HX或RS21607+FSH+HX的培养液中培养与上述相同时间后的CEOs的卵丘细胞通过WesternBlot分析MAPK的表达情况，结果发现，RS21607部分抑制了猪卵母细胞减数分裂成熟过程中卵丘细胞中MAPK的磷酸化。这些结果表明，FSH确实应用MAS作为下游的一个必要的信号分子来诱导猪卵母细胞减数分裂成熟，而且MAS对卵母细胞减数分裂成熟的作用是通过激活MAPK通路而实现的。 试验三检测了T-MAS对哺乳动物精子功能的影响。首先用1-20μMT-MAS处理HX抑制的猪CEOs44h后，发现其对猪卵母细胞成熟没有影响(P＞0.05)。然后利用精子三重染色法分析得到，经10μM或20μMT-MAS处理1h后的猪精子发生顶体反应的百分率为24.3±0.9％及41.2±1.7％，明显较对照组高(14.2±1.2％，P＜0.01)。而1μMT-MAS对精子顶体反应无影响。同时用T-MAS代替咖啡因体外处理猪精子后并借助于体外培养的猪卵母细胞研究了MAS对精子受精能力的影响。以受精后卵裂率及桑椹胚的比率来作为检测猪精子受精能力的指标。结果表明，10μM或20μMT-MAS处理组的卵裂率分别是53.3±1.9％及65.8±2.6％，明显高于对照组的卵裂率(16.6±5.8％，P＜0.01)；而且其对应的桑椹胚比率都显著高于对照组(P＜0.01)。利用RT-PCR，我们未检测到精子自身表达CYP51基因。但通过组织学方法对精子体内获能的部位输卵管进行CYP51蛋白的检测后发现，CYP51蛋白在卵泡期及黄体期的猪输卵管有广泛的表达。所有的结果提示我们，体外T-MAS可诱导猪精子顶体反应及提高其受精能力；在体内，猪输卵管中表达的CYP51蛋白介导的T-MAS可能参与了精子顶体反应和受精能力的调节。 综上所述，本论文的研究结果可以清楚地表明，MAS作为FSH下游的一个必要的信号分子，可诱导猪卵母细胞体外减数分裂的恢复及第一次减数分裂成熟，该作用是通过PKC及MAPK信号通路的激活而实现的；同时T-MAS可促进猪精子受精能力的提高，可能作为体内一个生理性诱导因子而起作用。

目录

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