猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2抗原表位的鉴定及其在病毒增殖中的调控分析

摘要

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respireatorysyndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征的接触性传染病。本研究(1)应用杂交瘤细胞技术成功地制备出针对PRRSV BJ-4非结构蛋白Nsp1、Nsp2和Nsp3的单克隆抗体；(2)利用Nsp2单抗及PRRSV阳性血清分析了PRRSV BJ-4 Nsp2高变区的B细胞线性表位；(3)分析了PRRSV BJ-4感染猪血清中Nsp2抗体的产生动态；(4)利用Nsp2单克隆抗分析了PRRSV BJ-4在感染细胞过程中Nsp2对病毒复制增殖的调控作用。研究结果为深入分析猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2的生物学功能奠定了重要的理论基础。 在利用分子生物学软件GOLDKEY对PRRSV BJ-4非结构蛋白Nsp1、Nsp2和Nsp3进行抗原相关信息分析的基础上，设计针对Nsp1、Nsp2和Nsp3抗原表位富集区域的特异性引物，采用RT-PCR扩增分别得到长约1106bp、1505bp和833bp的特异性片段。将目的片段克隆到原核表达载体pET-32a，经IPTG诱导表达。结果表明，Nsp1、Nsp2和Nsp3基因片段在大肠杆菌中表达的重组蛋白分子量分别为43.5kDa、68.3kDa和32.5kDa，重组蛋白的表达量分别为35.6％、28.8％和46.9％。Western blotting分析结果显示，重组蛋白可被猪源PRRSV阳性血清所识别。 以纯化的重组蛋白rNsp1、rNsp2和rNsp3作为免疫原，采用杂交瘤细胞技术制备出1株、6株和2株分别针对Nsp1、Nsp2和Nsp3的单克隆抗体。经间接ELISA、间接免疫荧光试验和Westernblotting鉴定表明，9株单克隆抗体均能够特异、单一地识别各自所针对的重组蛋白：亚型鉴定结果显示9株单抗均属IgG2a亚类，轻链均为к型；对单抗识别表位的分析表明，针对Nsp2的6株单抗和Nsp3的2株单抗各自所识别的抗原位点不同。 利用纯化的rNsp2作为包被抗原，建立了检测Nsp2抗体的间接ELISA。用PRRSV BJ-4感染健康仔猪(n=3)，分析了感染后血清中Nsp2抗体动态变化。结果表明，感染后14 d(DPI)可检测到Nsp2抗体(n=2)，21DPI全部转阳，于42DPI时达到高峰，此后趋于平缓。由此表明，Nsp2是一种免疫原性蛋白，在PRRSV感染过程中可以诱导感染猪产生特异性抗体。 基于GOLDKEY和DNAStar软件对PRRSV BJ-4 Nsp2区优势抗原表位的预测，设计并合成8个合成肽段(SPs)，利用6株Nsp2单克隆抗体和PRRSV BJ-4阳性猪血清，采用Pepscan技术对Nsp2区B细胞抗原表位进行了分析。结果鉴定山存在于PRRSV BJ-4 Nsp2高变区中的7个B细胞线性表位，即 SPI(T<'73>LPERVRPPDDWAT<'86>)， SP2(D<'385>ELKDQMEED<'394>)， SP4(Q<'437>PRKTKPVKSLPERK<'451>)，SP5(P<'452>VPAPRRKVGSDCGS<'466>)，SP6(P<'467>VSLGGDVPNS<'477>)，SP7(T<'530>VSRPVTPLSEPIPV<'544>)，SP8(p<'545>SAPRRKFQQVKRL<'557>)，其中SP1，SP2，SP5，SP6是新发现的存在于北美洲型毒株Nsp2中的表位。SP4，SP5，SP6和SP8均能与21～70DPI所有时段的阳性血清反应，表明这4个表位是Nsp2中的免疫优势表位。序列分析发现SP1，SP2，SP4和SP5在北美洲型毒株中相对保守，而SP6，SP7和SP8在各毒株中高度变异。以上结果丰富了PRRSV Nsp2抗原表位图谱，为进一步研究Nsp2的相关功能及血清学标记疫苗的开发奠定了基础。 利用Nsp2单克隆抗体，采用TCID<,50>测定、Real-time FQ-PCR定量分析和间接免疫荧光试验等分析了Nsp2对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM)和MARC-145细胞增殖的调控作用，结果表明，与Nsp2单克隆抗体作用后可导致PRRSV BJ-4感染PAM后病毒滴度显著增高(P<0.05)； 在培养基中加入4％单克隆抗体的条件下，PRRSV BJ-4在MARC-145细胞上的增殖能力有所增强，达到最高增殖滴度的培养时间比对照组提前12h，而且在感染后12～96h病毒滴度明显高于对照组，在感染后36h、48h、60h和72h差异显著(P<0.05)；细胞内Nsp2的表达量比对照组有所升高，且Nsp2由原来分布在核膜周围区域转移到整个胞浆中，而细胞表面Nsp2的表达量比对照组显著下调(P<0.01)。研究结果提示，Nsp2对PRRSV感染细胞中的增殖具有一定的负调控作用。

目录

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论文说明：图表目录、缩略词表

声明

第一章引言

1.1国内外研究现状

1.2研究目的与意义

1.3研究内容与技术路线

1.4研究目标

第二章PRRSV BJ-4非结构蛋白Nsp1,Nsp2和Nsp3的原核表达与纯化

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5小结

第三章PRRSV BJ-4非结构蛋白 Nsp1，Nsp2和Nsp3单克隆抗体的制备

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5小结

第四章PRRSV BJ-4感染仔猪血清中Nsp2抗体产生的动态分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5小结

第五章PRRSV BJ-4 Nsp2的B细胞免疫原性表位的鉴定

5.1前言

5.2材料与方法

5.3结果与分析

5.4讨论

5.5小结

第六章Nsp2对PRRSV在PAM和MARC-145上增殖的调控分析

6.1前言

6.2材料与方法

6.3结果与分析

6.4讨论

6.5小结

第七章结论

第八章创新点

第九章文献综述

参考文献

致 谢

附录

作者简介