人工诱导鸡性反转及鸡性别决定遗传机制研究

摘要

鸡的性别决定与分化过程与哺乳动物存在很大差别，容易受到性激素变化的影响。自然条件下的性反转现象在历史上早有记载。由于性反转鸡是研究鸟类性别决定与分化的理想材料，因此近年来研究者们尝试利用各种方法诱导产生性反转鸡来对这一机制进行研究。本课题以伴性矮小型鸡为研究对象，在鸡胚性别决定和分化的关键时期注入芳香化酶抑制剂-Fadrozole和Letrozole，干扰雌激素正常合成，人工诱导了鸡的性反转。应用实时荧光定量PCR检测性反转和对照组鸡胚性腺中性别决定候选基因的表达时间及表达量差异，结合前人已有试验数据，初步构建了鸡性别决定和分化的路径图；追踪了试验组鸡只体内性激素水平变化对其生长发育的影响；在性反转鸡成年后，根据其生殖生理机能的变化，结合胚胎期性别决定候选基因表达的数据，对鸡性别决定机制的特点进行了探讨。最后，为了分析造成性反转鸡可育的真正原因，采用孟德尔分离群体设计，构建了遗传背景相同而表型差异显著的试验鸡群，对伴性矮小型鸡与普通型鸡GH、IGF-1分泌水平的差异和生长激素受体突变对伴性矮小型公鸡繁殖力的影响进行了研究。结果表明： 1) 将1mg非甾体类芳香化酶抑制剂Fadrozole注入孵化3.5天的鸡胚，成功诱导遗传性别为雌性的个体表观性别反转为雄性。试验组获得的104只性反转鸡在成年后剖检发现，生殖系统发生部分或完全雄性化。Fadrozole处理对个体生长没有影响。另一种非甾体类芳香化酶抑制剂Letrozole 0.1mg处理无法诱导个体发生性反转，试验组母鸡仅在4-10周龄表现出非典型的雄性第二性征，成年后则发育为正常母鸡。Letrozole对伴性矮小型鸡8周龄胫长及各生长阶段增重影响均不显著(P>0.05)。 2) 以Fadrozole处理组鸡胚为试验材料，本研究检测了鸡性别决定候选基因DMRT1、PKCIW和FET1的表达变化。在整个性别决定关键时期(E4.5～E10.5)，DMRT1在雄性的表达量显著高于雌性(P<0.05)，并且在ZW性反转鸡胚中表达大幅上升，表咀DMRT1的上调表达与睾丸形成是相关的。PKCIW基因在雌性特异表达并在性反转鸡胚中表达上升，这可能与其特殊作用模式相关，但即便性反转鸡胚中PKCIW达代偿性升高，也未能阻止ZW性反转个体性腺发育为睾丸。FET1为雌性特异表达，但在性反转鸡胚中表达无变化。本试验结果支持DMRT1是鸡睾丸决定因子的假说。 3) 通过观测成年性反转鸡生殖机能的变化，本试验首次发现2只可育的性反转鸡，它们不仅具有雄性第二性征，并且可以产生精液、繁育正常的后代。2只性反转鸡精液中精子密度很低，分别为12.2和14.6亿/mL；精液中存在大量畸形精子，占到精子总数的79％和69％：但人工授精后仍获得正常后代，入孵蛋孵化率分别为5.6％和22.4％。本试验使用FISH技术在性反转鸡精液中检测到W精子，并利用快慢羽杂交试验证实了W精子具有正常的受精能力。因此，精子细胞的分化发育主要取决于睾丸中的支持细胞和间质细胞，而与其自身遗传物质无关。测定性反转个体的血清性激素浓度发现，可育性反转鸡的雄激素水平上升，而雌激素下降，但与不可育性反转个体差异不显著(P>0.05)。本试验结果说明血清性激素水平只能部分反映个体的性反转程度，而不是造成可育性反转的主要因素。 4) 为了寻找造成性反转鸡可育的真正原因，本研究分析了伴性矮小型公鸡及其全同胞普通型公鸡GH、IGF-1分泌水平的差异和伴性矮小基因对雄性生殖的影响。结果显示，伴性矮小型公鸡生长受伴性矮小基因影响，成年体重比普通型个体低36.4％。但其生殖功能正常，30周龄的各项精液品质指标，包括精液体积，精子密度，活力，活率，酸碱度和畸形精子数均与普通型公鸡无异。伴性矮小型公鸡受精率95.2％，普通型个体92.4％。检测血清和精清中GH和IGF-1浓度后发现，‘伴性矮小型公鸡血清和精清中的GH含量显著高于普通型公鸡(P<0.05)；伴性矮小型公鸡血清IGF-1极低，但精清IGF-1浓度与其全同胞普通型公鸡相近。GHR缺失不影响伴性矮小型公鸡的生殖功能，因此，伴性矮小型性反转鸡的可育性似乎是其睾丸组织内GH和IGF-1功能模式与普通型性反转鸡不同造成的。

目录

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引言

第一章文献综述

第二章芳香化酶抑制剂诱导鸡性反转及其对生长发育的影响

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1试验材料

2.2.2主要仪器

2.2.3主要试剂

2.2.4试验方法

2.2.5统计分析

2.3结果与分析

2.3.1芳香化酶抑制剂Fadrozole诱导鸡性反转的结果

2.3.2芳香化酶抑制剂Fadrozole处理对伴性矮小型鸡生长发育的影响

2.3.3芳香化酶抑制剂Letrozole诱导鸡性反转的结果

2.3.4芳香化酶抑制剂Letrozole处理对伴性矮小型鸡生长发育的影响

2.3.5 PCR方法鉴别雌雄的结果

2.4讨论

2.4.1芳香化酶抑制剂Fadrozole诱导鸡性反转及其对生长发育的影响

2.4.2芳香化酶抑制剂Letrozole诱导鸡性反转及其对生长发育的影响

第三章鸟类性别决定候选基因在性反转鸡胚中的表达

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1试验材料

3.2.2主要试剂

3.2.3试验方法

3.2.4统计分析

3.3结果

3.3.1 GAPDH检测RNA质量的结果

3.3.2鸟类性别决定候选基因的表达

3.4讨论

第四章性反转鸡的可育性研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1试验材料

4.2.2试验方法

4.2.3统计分析

4.3结果与分析

4.3.1性反转结果

4.3.2性反转鸡可育性研究

4.3.3血清性激素水平检测

4.3.4精液品质测定

4.3.5 W精子受精能力

4.4讨论

第五章GH、IGF-1与伴性矮小型鸡的雄性生殖机能

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1试验动物

5.2.2试验方法

5.2.3统计分析

5.3结果与分析

5.3.1基因型鉴定

5.3.2各基因型公鸡生长性状

5.3.3激素测定结果

5.3.4各基因型公鸡精液品质分析

5.4讨论

第六章小结

参考文献

致 谢

作者简历