p53和c-myc在细胞周期调控及苯并（a）芘致癌过程中作用机理的研究

摘要

苯并芘(benzo(a)pyrene，BaP)是环境中存在的一种化学致癌物，在体内能诱导基因突变或影响细胞周期调控相关基因的表达，导致细胞周期的有序性和精确性受到破坏，造成细胞周期紊乱，甚至恶性转化，最终发生癌变。人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast，HELF)和人肺腺癌细胞系A549是p53正常表达细胞系，人肺腺癌细胞系H1299属于p53缺失型细胞系。本研究首先用BaP染毒HELF、A549和H1299细胞，结果表明BaP可以促进HELF和A549细胞生长速度加快，体积增大，同时促进细胞由G1期向S期和G2/M期的转换，但BaP对H1299细胞没有影响。因此说明BaP能显著促进细胞的生长和增殖，并且具有p53表达依赖性。其次，对BaP作用后细胞内p53及下游基因和蛋白的表达进行了检测，结果表明BaP显著上调HELF和A549细胞内p53 mRNA和蛋白的表达，同时促进p53下游基因cyclin D1、CDK2、CDK4和p21 mRNA和蛋白的表达，降低cyclin E的表达。因此说明BaP作用细胞后cyclin D1、CDK2和CDK4的表达上调，进而影响细胞周期的有序进行。 抑癌基因p53在BaP影响细胞周期调控的过程中发挥重要作用。p53作为转录因子，可诱导下游相关蛋白的表达，从而达到调控细胞周期的作用。本研究利用野生型和突变型p53质粒分别转染A549细胞，结果表明野生型p53可以延缓细胞生长，减小细胞体积，使细胞周期阻滞于G1期。野生型p53对细胞周期的调控是通过降低cyclin A、cyclin E、CDK2和CDK4的表达，同时增加p21的表达来实现的，而突变型p53上调CDK2的表达引起细胞周期紊乱。转染野生型p53的A549细胞染毒BaP后，细胞生长加快，体积增大，促进细胞由G1期向S期和G2/M期的转换，同时上调cyclinD1、CDK2、CDK4和p21的表达，并且下调cyclin A和cyclin E的表达。结果表明细胞在BaP损伤后会诱导p53的表达，使细胞周期阻滞于G1期进行损伤修复，但p53无法拮抗化学致癌物高浓度长时间的刺激，BaP作用细胞后cyclin D1、CDK2和CDK4的表达上调，从而干扰p53对细胞周期的负调控。 原癌基因c-myc在细胞周期调控中发挥重要作用，在周期紊乱细胞和大量癌细胞中都可以检测到c-myc的过表达。本研究用c-myc真核表达质粒pcDNA3c-myc转染c-myc低表达的HELF细胞，结果S期细胞增多，G2/M期细胞减少，cyclin D3、cyclinE、cyclinA、CDK2和CDK4表达增多，p21和p27表达减少。同时我们利用RNAi技术，将c-myc RNA干扰质粒pSilencer-c-myc转染入c-myc高表达的A549内，发现其G1期细胞增多，S期细胞减少，cyclin D3、cyclin E、cyclin A、CDK2和CDK4的表达减少，而p21和p27表达增多。因此上调c-myc表达促进HELF细胞周期进程而下调其表达阻滞A549细胞于G1期。其中cyclinA相对于c-myc表达改变是最敏感的，而cyclin D1在两种细胞中无显著变化。因此c-myc调控细胞周期可能存在下述一种机制，即依赖于cyclin A、D3、E、CDK2、CDK4、p21和p27而不依赖于cyclin D1。

目录

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论文说明：插图和附表清单及缩略词表

声明

第一章绪论

1文献综述

1.1细胞周期调控与肿瘤

1.2抑癌基因p53在细胞周期调控及肿瘤发生中的作用

1.3原癌基因c-myc在细胞周期调控及肿瘤发生中的作用

2引言

2.1研究目的和意义

2.2国内外研究现状

2.3研究内容和方法

第二章化学致癌物BaP影响细胞周期调控机理的研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1 BaP对细胞生长的影响

3.2 BaP对细胞大小的影响

3.3 BaP对细胞周期的影响

3.4总RNA鉴定结果

3.5 BaP对细胞mRNA表达的影响

3.6 BaP对细胞蛋白表达的影响

4讨论

4.1 BaP对细胞周期的影响

4.2 BaP对p53的影响

4.3 BaP对cyclin、CDK和CKI的影响

5小结

第三章抑癌基因p53对细胞周期调控机理的研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1质粒鉴定结果

3.2 p53对A549细胞的影响

3.3 BaP对野生型p53转染A549细胞的影响

3.4 p21对A549细胞的影响

4讨论

5小结

第四章原癌基因c-myc对细胞周期调控机理的研究

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1质粒鉴定结果

3.2 c-myc对细胞生长的影响

3.3 c-myc对细胞大小的影响

3.4 c-myc对细胞周期的影响

3.5 HELF中c-myc对下游基因mRNA和蛋白表达的影响

3.6 A549中c-myc对下游基因mRNA和蛋白表达的影响

3.7 c-myc对cyclin-CDK复合物的影响

3.8 c-myc和cyclin A共转染对细胞周期的影响

4讨论

4.1 c-myc对细胞周期的影响

4.2 c-myc对cyclin表达的影响

4.3 c-myc对CDK表达的影响

4.4 c-myc对CKI表达的影响

4.5 cyclin A在c-myc细胞周期调控过程中的作用

4.6 cyclin D1在c-myc细胞周期调控过程中的作用

5小结

结论

创新点

参考文献

致谢

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