骨骼肌环核苷酸磷酸二酯酶表达与活性及其中药作用研究

摘要

环核苷酸(cAMP、GMP)作为第二信使，在各种组织细胞增殖、分化和终末细胞功能中扮演着重要的角色，而磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是调节细胞内cAMP、cGMP水平的关键酶。为探讨中药能否通过调节骨骼肌PDE提高环核苷酸水平，促进动物生长，本研究运用RT-PCR、细胞培养、HPLC、ISA、免疫细胞化学和图像分析等技术，进行了骨骼肌组织和细胞10个PDE家族的18个同功酶亚型mRNA表达，中药调节骨骼肌cAMP PDE活性，中药促骨骼肌原代培养细胞蛋白合成作用，以及对中药促动物生长作用的研究。结果如下： 成功设计了18对PDE引物，通过RT-PCR方法检测到中国实验用小型猪骨骼肌组织除PDE1B和PDE11A外共16个同功酶亚型mRNA表达；ICR小鼠骨骼肌组织和细胞除PDE8B外共17个同功酶亚型mRNA表达；各亚型mRNA表达程度存在差异；猪和鼠骨骼肌组织和细胞中以cAMP特异性的PDE4A、PDE4B和PDE7A为主要表达。 HPLC法检测了近200种常用中药对小鼠骨骼肌组织cAMP PDE活性的影响，秦皮等18味中药对cAMP：PDE活性具有促进作用：其余中药对cAMP PDE活性有不同程度的抑制作用，其中石韦等62味中药的抑制率超过20％；抑制率超过50％的中药有青皮、密蒙花、玄参、生艾叶、木瓜、地骨皮、牛蒡子、附子、枳实、胡黄连10味中药。 细胞培养、HPLC、ELISA和考马斯亮蓝方法检测到中药牛蒡子有效成分牛蒡子苷在浓度为2.5μg/ml时，显著抑制骨骼肌原代培养细胞cAMP PDE活性(P<0.01)，提高细胞内cAMP含量(P<0.05)，促进细胞蛋白质的合成(P<0.01)；RT-PCR、免疫细胞化学染色和图像分析技术检测结果表明，主要表达的cAMP特异性PDE包括PDE4A、PDE4B和PDE7A的mRNA表达和蛋白合成无明显变化(P>0.05)。 HPLC和ELISA等方法检测到中药牛蒡子的三个浓度和其有效成分牛蒡子苷的两个低浓度都能极显著抑制骨骼肌组织cAMP PDE活性(P<0.01或P<0.001)，显著或极显著提高骨骼肌组织cAMP含量(P<0.05或P<0.01或P<0.001)，三个浓度的牛蒡子都能极显著提高血浆中cAMP水平(P<0.01或P<0.001)，而三个浓度的牛蒡子苷能够使cAMP水平显著提高(P<0.05)。 动物喂养试验表明，牛蒡子苷能显著提高小鼠生长速度，牛蒡子能极显著提高小鼠生长速度。其作用主要是通过抑制PDE活性，升高cAMP水平，进而促进蛋白合成实现。 上述结果表明，PDE同功酶在骨骼肌组织细胞中广泛表达，以cAMP特异性PDE为主要分布；大部分常用中药对骨骼肌cAMP PDE活性都有抑制作用；对骨骼肌cAMP PDE活性具有较高抑制率的中药能够提高cAMP含量，促进骨骼肌原代培养细胞蛋白质的合成，并促进动物生长。 本研究探讨了骨骼肌PDE同功酶表达规律，验证了第二信使环核苷酸在骨骼肌生长过程中的作用，证明了中药通过抑制PDE活性，升高cAMP水平促进蛋白质合成的可行性，揭示了中药通过调节机体PDE同功酶、提高环核苷酸水平，从而促进动物生长的作用机制，使以组织特异性表达的PDE为靶点，筛选其选择性中药抑制剂，开发新型中药动物生长促进剂成为可能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词词表

声明

第一章引言

第一节研究目的和意义

1.骨骼肌的生长发育与蛋白质代谢的关系

2.环核苷酸对蛋白质代谢的重要调节作用

3.磷酸二酯酶对环核苷酸水平的调节作用

4.磷酸二酯酶与动物生长的密切关系

5.中药对环核苷酸和磷酸二酯酶的调节作用

第二节环核苷酸的研究进展

1.环核苷酸的基本特点及分布

2.环核苷酸在动物体内的含量及分布

3.环核苷酸的生理功能

4.环核苷酸在动物生产中的应用效果

5.环核苷酸的应用前景以及存在的问题

第三节磷酸二酯酶同功酶研究进展

1.PDE的发现

2.PDE的分类

3.PDE的分子结构及功能

4.PDE的表达与分布

5.PDE的抑制剂

6.小结

第四节中药对环核苷酸作用的研究进展

第五节研究内容和方法及总体设计

1.研究内容和方法

2.总体设计

第二章骨骼肌环核苷酸磷酸二酯酶同功酶表达的研究

第一节环核苷酸PDE基因表达引物设计

1.方法

2.结果

3.讨论

第二节环核苷酸PDE同功酶mRNA在中国实验用小型猪骨骼肌组织的表达

1.材料和方法

2结果

3.讨论

第三节环核苷酸PDE同功酶mRNA在小鼠骨骼肌组织中的表达

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

第三章 骨骼肌磷酸二酯酶活性调节中药的筛选

第一节中药对骨骼肌cAMP PDE活性的影响测定

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第四章中药调控骨骼肌细胞环核苷酸磷酸二酯酶的研究

第一节小鼠骨骼肌细胞的原代培养

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二节环核苷酸PDE同功酶mRNA在小鼠骨骼肌原代培养细胞中的表达

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第三节环核苷酸对骨骼肌原代培养细胞蛋白质合成的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第四节牛蒡子苷对原代培养骨骼肌细胞cAMPPDE活性及蛋白质合成的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第五节牛蒡子苷对原代培养骨骼肌细胞环核苷酸PDE同功酶mRNA表达的影响

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

第六节牛蒡子苷对小鼠原代骨骼肌细胞环核苷酸PDE蛋白合成的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第五章中药对骨骼肌磷酸二酯酶活性调控效应的动物试验

第一节牛蒡子和牛蒡子苷对小鼠增重的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二节牛蒡子和牛蒡子苷对小鼠骨骼肌cAMP含量的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第三节牛蒡子和牛蒡子苷对小鼠骨骼肌cAMP PDE活性的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第四节牛蒡子和牛蒡子苷对小鼠血浆cAMP水平的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第六章总结和结论

参考文献

作者简历

致 谢