猪中性粒细胞磷酸二酯酶表达及活性与中药抗炎作用的研究

摘要

第二信使cAMP、CGMP在各种信号转导途径及细胞代谢中均发挥着主导的调节作用。磷酸二酯酶P(DE)是cAMP/PKA和cGMP/PKG信号转导途径中的关键性环节，对调节细胞cAMP、cGMP含量具有决定性作用。中性粒细胞是最重要的炎症细胞，其功能与cAMP水平密切相关，且胞内PDE同功酶中以特异性水解cAMP的PDE4占主导优势，而以中性粒细胞PDE变化来研究中药的抗炎作用则未见报道。因此，以中性粒细胞PDE为靶点来筛选特异性中药抑制剂，对中性粒细胞活性进行调节，控制其活化和继发的炎症，则对各种炎症性疾病的治疗具有普遍意义。该项研究不仅能揭示炎症过程中性粒细胞功能与PDE表达及活性的变化规律，而且能从分子水平丰富中药的抗炎机制。研究内容如下： 以RT-PCR检测PDE表达，以HPIC测定PDE活性。结果表明：检测的18个PDE亚型中，在猪中性粒细胞表达的有PDElB、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A共15个亚型，特异性抑制剂实验表明PDE4、PDE5分别为水解cAMP、cGMP的两个主要存在的型；猪中性粒细胞内存在高活性的PDE，PDE量在一定范围内，与其活性存在良好的线性关系。因此，以猪中性粒细胞为样本提取PDE可作为筛选PDE中药抑制剂的方法。 实验选取了祛邪、扶正等共79味中药。通过PDE活性抑制实验，筛选出自芍等多昧高效抑制中药，同时也发现某些中药如薏苡仁等对PDE活性具有显著促进作用。考察了高效抑制中药白芍、黄连和金银花主要有效成分芍药苷、小檗碱及绿原酸对PDE活性的影响，结果表明其抑制率均较低。因此，鉴于中药药效的整体性及成分的复杂性，挑选白芍等4昧中药精制成注射液，PDE抑制实验表明仅有白芍对其抑制率最高。因此，选出白芍注射液作为‘PDE抑制剂研究其抗炎作用及对。PDE表达和活性的影响。 以细胞色素C还原法检测呼吸爆发，半定量RT-PCR测定PDE表达。结果表明白芍注射液呈剂量依赖性抑制中性粒细胞呼吸爆发，且对其弹性蛋白酶释放具有双重调节作用，即低浓度抑制、高浓度促进作用。自芍注射液对培养中性粒细胞PDE活性具有明显抑制作用，且能在基因转录水平抑制其主要存在的PDE4B的表达。以上结果提示白芍注射液对PDE表达、活性的抑制和对中性粒细胞功能的影响存在一定的相关性，也表明白芍注射液体外具有较好的抗炎作用。 进一步的动物实验表明白芍注射液对小鼠耳肿胀模型耳肿胀度具有显著的抑制作用，对小鼠胸膜炎模型血浆MDA含量具有明显降低作用，显示了较好的抗炎性。HPIC指纹图谱分析表明自芍注射液主要存在5种成分，其中包括芍药苷。由于芍药苷为弱的PDE抑制剂，因此，其余成分的研究显得尤为重要，这有助于发现新的高特异性PDE抑制剂。鉴于白芍注射液体内外显示的良好抗炎作用，提示其有望成为用于临床的一种新型、高效抗炎药，但对于它在体内的作用机制、安全性评价及其疗效仍需深入研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、英文缩略词表

声明

第一章引言

1研究目的和意义

2国内外研究现状

2.1磷酸二酯酶(PDE)研究进展

2.2 PDE活性检测研究进展

2.3中药对PDE影响研究进展

2.4 PDE抑制剂对炎症细胞影响研究进展

2.5展望

3本研究要解决的问题

第二章中性粒细胞PDE基因表达与活性检测

1材料与方法

1.1实验动物

1.2仪器

1.3主要试剂

1.4主要溶液的配制

1.5实验方法

1.6统计分析

2结果

2.1中性粒细胞的分离效果

2.2总RNA纯度分析

2.3猪中性粒细胞PDE基因表达

2.4猪中性粒细胞PDE与已知序列的同源性

2.5猪中性粒细胞PDE活性变化

2.6 Rolipram、sildenafil对PDE活性的影响

3讨论

3.1猪中性粒细胞的分离纯化

3.2 PDE在猪中性粒细胞的表达

3.3猪中性粒细胞PDE活性检测

3.4猪中性粒细胞主要存在的PDE

4小结

第三章cAMP-PDE高效抑制中药的筛选

1材料与方法

1.1中药的选取

1.2仪器

1.3主要试剂

1.4主要溶液配制

1.5实验方法

1.6统计分析

2结果

2.1中药对cAMP-PDE活性的影响

2.2中药标准品对cAMP-PDE活性的影响

2.3中药注射液对中性粒细胞cAMP-PDE活性的影响

3 讨论

3.1中药对cAMP-PDE的影响

3.2芍药苷等对cAMP-PDE的影响

3.3注射液对cAMP-PDE的影响

4小结

第四章白芍注射液对中性粒细胞功能及PDE4B表达的影响

1材料与方法

1.1实验材料

1.2仪器

1.3主要试剂

1.4主要溶液配制

1.5实验方法

1.6统计分析

2结果

2.1对培养中性粒细胞cAMP-PDE活性的影响

2.2对中性粒细胞弹性蛋白酶释放的影响

2.3对中性粒细胞呼吸爆发的影响

2.4对中性粒细胞PDE4B表达的影响

3讨论

3.1对培养中性粒细胞cAMP-PDE活性影响

3.2对中性粒细胞弹性蛋白酶释放的影响

3.3对中性粒细胞呼吸爆发的影响

3.4对中性粒细胞PDE4B基因表达的影响

4小结

第五章白芍注射液抗炎效果观察及指纹图谱分析

1材料与方法

1.1实验动物

1.2仪器

1.3主要试剂

1.4主要溶液配制

1.5实验方法

1.6统计分析

2结果

2.1对小鼠耳肿胀模型的抗炎效果

2.2小鼠胸膜炎症实验

2.3白芍注射液指纹图谱分析

3讨论

3.1小鼠耳肿胀实验

3.2小鼠胸膜炎症实验

3.3白芍注射液指纹图谱分析

4小结

结论

创新点

参考文献

致谢

附录

个人简介