抗大豆抗原蛋白β-conglycinin单克隆抗体的制备及初步应用

摘要

本研究以半抗原为免疫原，成功制备了特异性的抗大豆β-conglycinin单克隆抗体，并在定量检测、亲和层析和体外小肠上皮细胞结合试验中进行了初步应用。研究共包括四个试验。试验1，以人工合成的对应于β-conglycinin分子山α’亚基上的一段抗原表位肽(RPQHPER，78-84α’)作为半抗原，然后与载体蛋白(牛血清白蛋白，OVA)交联后作为免疫原制备了抗β-conglycinin单克隆抗体(Mab 6G<,4>)。经竞争性、非竞争性酶联免疫吸附法(ELISA)和Western Blotting等方法鉴定，结果表明：Mab 6G<,4>属于IgG<,1>类型抗体：该抗体能与β-conglycinin特异性结合，亲和常数达6.9×10<'9>L/mol，但与其结构或功能类似物glycinin无明显的交叉反应：抗体能识别β-conglycinin分子中的α和α’亚基。由此可知，制备的Mab 6G<,4>为大豆制品中β-conglycinin的定量检测，为探讨β-conglycinin在仔猪消化道内的分布及其致敏机理提供了一个潜在的分析工具。试验2，以单克隆抗体(Mab 6G<,4>)为工具，建立了定量检测大豆制品中β-conglycinin的竞争性ELISA方法。结果表明，根据Mab 6G<,4>的标准校正曲线，抑制抗原与抗体结合50％时β-conglycinin的浓度(IC<,50>)为4.7 ng/mL,检测限为2.0 ng/mL；经精密度和回收率分析，Mab 6G<,4>-ELISA方法表现出较好的灵敏度、精密度和可重复性。因此，建立的Mab 6G<,4>-ELISA方法为β-conglycinin的定量检测提供了一个有效工具。试验3，将单克隆抗体Mab 6G<,4>与CNBr活化的Sepharose 4B琼脂糖凝胶偶联后制备免疫亲和柱，用亲和层析的方法分离纯化大豆中的β-conglycinin。结果表明，该免疫亲和层析法能有效提取大豆中的β-conglycinin，其纯度达92.9％。高纯度β-conglycinin的获得为在后续研究中揭示单个β-conglycinin分子的抗营养作用和致敏机理奠定了基础。试验4，以单克隆抗体F(ab’)<,2>片段为工具，应用间接免疫荧光染色法分析了大豆β-conglycinin在7日龄仔猪十二指肠、空肠和回肠上皮细胞上的结合情况，并检验Mab 6G<,4>的应用效果。结果表明，大豆β-conglycinin能广泛结合于仔猪十二指肠、空肠和回肠上皮细胞，并证实了所制备的单抗Mab 6G<,4>可应用于细胞定位分析和体内代谢研究。综合上述试验，得出如下结论：以大豆β-conglycinin分子α’亚基上的一段抗原表位肽作为半抗原制备的单克隆抗体表现出较强的特异性和亲合力。将其应用于大豆β-conglycinin的定量检测、分离纯化以及β-conglycinin在细胞与组织中的定位分析均具有很好的研究价值和应用前景。此外，该抗体也可为今后进一步探讨β-conglycinin在仔猪体内的致敏机理提供一个有效的分析工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第一章绪论

1研究目的和意义

2国内外研究现状

3研究内容与方法

4技术路线

第二章试验研究

试验一抗大豆抗原蛋白β-conglycinin单克隆抗体的制备和鉴定

1前言

2材料与方法

3结果与讨论

4小结

试验二大豆β-conglycinin竞争性ELISA检测方法的建立

1前言

2材料与方法

3结果与讨论

4小结

试验三大豆β-conglycinin免疫亲和层析纯化方法的研究

1前言

2材料与方法

3结果与讨论

4小结

试验四特异性单抗展示大豆β-conglycinin在仔猪小肠黏膜上皮细胞中的结合研究

1前言

2材料与方法

3结果与讨论

4小结

第三章结论与建议

参考文献

致谢

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