口蹄疫病毒OH/99株细胞传代毒全基因组序列测定及其感染性克隆的构建

摘要

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的偶蹄动物感染的一种烈性传染病,该病的发生和流行严重危害畜牧业的持续健康发展,因此,世界各国非常重视对该病的研究.本研究根据FMDV的基因组核苷酸序列设计并合成了数对反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的寡核苷酸引物.利用3'-RACE方法从OH/99株细胞传代毒中扩增得到一7300bp片段,同时,采用常规RT-PCR技术扩增得到其5'-非翻译区(5'-untranslated region,5'-UTR)的S片段和内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES),分别克隆至pGEM-T Easy载体中进行序列测定.应用连接PCR的方法将15bp poly(C)序列插入S和IRES两片段之间,并将连接片段插入pBluescript SK,然后将7300bp片段从pGEM-T Easy载体上切下,插入重组体pBluescript SK中,构建了OH/99株全长cDNA.以全长cDNA重组质粒为模板进行全长PCR扩增,PCR产物经Nde Ⅰ消化后,利用噬菌体T7启动子聚合酶系统启始合成RNA转录本,借助脂质体将RNA转录本转染BHK-21细胞.转染细胞连续传3代后出现典型的细胞病变,通过RT-PCR和电子显微镜观察均确证了感染性病毒粒子的产生.将此基因工程毒接种乳鼠后出现了典型的临床症状,进一步说明了FMDV OH/99株感染性克隆构建成功.本研究为FMDV基因组结构和功能的研究奠定了良好的基础,也为新型疫苗的研究提供了非常有用的工具.

目录

摘要

ABSTRACT

1前言

2材料和方法

2.1材料

2.1.1病毒株、菌种、细胞和载体

2.1.2各种酶类和生物试剂

2.1.3引物设计

2.1.4实验动物

2.2方法

2.2.1口蹄疫病毒OH/99株全基因组的克隆

2.2.2口蹄疫病毒OH/99株全长cDNA的构建

2.2.3体外转录模板的制备

2.2.4体外转录本的制备

2.2.5 RNA转录本的纯化及鉴定

2.2.6 FMDV基因组RNA转染BHK-21细胞

2.2.7全长cDNA感染性的鉴定

3结果

3.1口蹄疫病毒OH/99株全基因组的克隆

3.2口蹄疫病毒OH/99株全长cDNA的分子克隆

3.3体外模板的制备

3.4体外转录

3.5全长cDNA感染性的鉴定

4讨论

结论

文献综述：RNA病毒的反向遗传达学及其在FMDV研究中的应用

参考文献

附录

致谢