环境激素对鱼类生殖影响生物检测方法的建立

摘要

当前，环境激素的生态效应已经引起人类的极大关注。由于环境激素种类多样，并且在环境中存在水平极低，为化学检测带来困难。因此，为了评价环境激素的污染状况及潜在危害，生物检测方法越来越受到人们的重视。在对环境激素的研究中，目前已经建立检测特异标志物--卵黄蛋白原的ELISA方法和普通RT-PCR方法。前者需要制备特异抗体，程序复杂，且相对于从分子水平进行的基因表达定量方法灵敏度仍有较大差距；而普通RT-PCR方法在基因表达定量方面也存在准确性较差的缺点，不能有效地反映剂量效应关系。本研究中通过对鱼类原代肝细胞暴露E2，采用Q-RT-PCR检测青鳉鱼和梭鱼VTG等基因的表达变化，期望建立较高灵敏度的环境雌激素效应评价方法。主要取得了如下研究结果： (1)本实验通过对青鲻鱼肝脏细胞原代培养，建立了稳定的毒理学实验模型，与传统的活体暴露实验相比，节约了实验动物材料、实验周期及实验耗材。为环境激素毒理学研究奠定了基础。 (2)本研究中成功建立了实时定量RT-PCR与原代培养青鳉鱼肝细胞相结合的invitro环境雌激素效应评价方法，并且显示出较高的灵敏度。 (3)VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L和ERa在体外培养青鳉鱼肝细胞中均与雌激素暴露浓度呈现较好的剂量效应关系，其中VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L，作为检测雌激素的生物标记物基因可优先选择。 (4)本文通过扩增梭鱼VTG、β-actin基因，测定基因序列，建立检测E2暴露后梭鱼肝细胞VTG表达的实时定量RT-PCR方法。为环境激素的动态检测和分析鱼类对内分泌干扰物质的敏感性分析提供了方法学基础。

目录

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论文说明：缩写词表

声明

第一章文献综述

1环境内分泌干扰物质的研究背景

1.1内分泌干扰物质的危害性

1.2内分泌干扰物质的毒理学研究

1.3雌激素及其类似物

2内分泌干扰物质的生物检测

2.1活体(In Vivo)与离体(In Vitro)检测

2.2 VTG在监测环境雌激素生物效应的应用

2.3卵黄蛋白原(Vitellogenin，VTG)的检测方法

2.4鱼类在研究环境激素生物效应中的应用

3选题背景与研究意义

第二章鱼肝细胞原代培养方法的建立

1实验材料

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器及耗材

2实验方法与步骤

2.1配液

2.2组织块培养法

2.3酶消化培养法(机械分散法与酶消化结合)

3结果与讨论

3.1肝细胞生长状况形态学观察结果

3.2讨论

4小结

第三章E2诱导青鳉鱼肝细胞基因表达Q-RT-PCR检测方法的建立

1实验材料

1.1材料

1.2试剂

1.3仪器

2实验方法与步骤

2.1目标基因的诱导表达

2.2基因表达分析

2.3数据处理方法

3结果与讨论

3.1实验结果

3.2讨论

4小结

第四章E2诱导梭鱼肝细胞基因表达Q-RT-PCR检测方法的建立

1实验材料

1.1材料

1.2试剂和仪器

2实验方法与步骤

2.1目标基因的诱导表达

2.2基因表达分析

3结果与讨论

3.1实验结果

3.2讨论

4本章小结

第五章结论与讨论

1结论

2讨论

致谢

参考文献

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