新孢子虫SRS2基因的克隆、表达及ELISA方法的建立

摘要

新孢子虫（Neospora caninum）是一种专性细胞内寄生的原虫，主要引起牛、狗等动物的神经肌肉性疾病和流产，尤其是奶牛的流产，严重影响养牛业的发展。新孢子虫病的早期诊断是有效控制该病发生和蔓延的重要手段。研究表明，新孢子虫表面蛋白NcSRS2具有较好的免疫原性，是新孢子虫病诊断和疫苗研究的重要候选抗原。本试验拟采用新孢子虫表面蛋白NcSRS2建立间接ELISA诊断方法，用于牛新孢子虫病诊断。 参考GenBank登录的新孢子虫NcSRS2全基因序列，在163～1141处设计一对引物，通过PCR扩增出NcSRS2的相应片段，构建T-A克隆，经PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析后，再亚克隆到表达载体pET-32a中，构建了重组质粒pET-32a-NcSRS2t，转化DH5α感受态细胞，经PCR扩增和酶切鉴定后，保存重组质粒。将重组质粒pET-32a-SRS2t转化表达菌BL21，用IPTG诱导表达融合蛋白NcSRS2t。Western blotting检测，表达的融合蛋白NcSRS2t能够被新孢子虫阳性血清所识别。 将表达的融合蛋白NcSRS2t收集、纯化后作为抗原，包被聚苯乙烯微量反应板，初步建立检测牛新孢子虫抗体的间接ELISA。试验结果表明，重组蛋白的最佳包被浓度为5μg/ml，最佳封闭时间为2h，检测血清稀释度为1：200，抗原和抗体作用时间为1h，HRP标记的兔抗牛IgG的工作浓度为1：5000，最佳显色时间为10min，用21mol/LH2SO4为终止液，确定阴阳性的临界OD值为0．275。

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第一章新孢子虫病研究进展

1病原及分类地位

2新孢子虫的生活史

3新孢子病的危害

4新孢子虫病的诊断方法

4.1临床诊断

4.2病原学诊断

4.3免疫学诊断

4.4分子生物学诊断

5新孢子虫病的防治

5.1药物治疗

5.2免疫预防

6目前新孢子虫用于检测和免疫原的主要抗原

6.1 NcSRS2(Nc-p43)

6.2 NcSAGl(Nc—p36)

6.3 NcDG1

6.4 NcDG2

6.5 NcGRA2

7预防措施

第二章NcSRS2基因的扩增、克隆及表达

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 NcSRS2基因表达蛋白的分析

2.2 NcSRS2t基因的克隆

2.3重组质粒PMD19T.NcSRS2t的鉴定

2.4序列测定与分析

2.5重组表达载体pET32a-NeSRS2t的构建与鉴定

2.6重组质粒在表达菌BL21中表达与SDS-PAGE分析

2.7目的基因在37℃和25℃低温条件下表达的分布

2.8融合蛋白的纯化结果

2.9表达产物的Western Blotting检测

3结论与讨论

3.1 NeSRS2基因及表达产物的特点

3.2 NcSRS2基因阶段表达片段的选择

第三章新孢子虫ELISA检测方法的建立

1材料与方法

1.1材料

1.2试验方法

2.结果

2.1重组蛋白浓度的测定结果

2.2 ELISA反应条件的优化

2.3阴阳性临界值的判定

2.4间接ELISA检测程序

3结论与讨论

参考文献

致 谢

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