稻瘟菌对三唑类杀菌剂丙环唑敏感性检测及农杆菌介导的稻瘟菌转化—致病缺陷突变体筛选

摘要

稻瘟病是水稻生产上的重要病害之一，病原菌为Magnaporthegrisea。本研究首先利用菌丝生长速率法，测定了采自广西、桂州、浙江、安徽、福建、江苏、广东省不同地区的53个稻瘟病菌菌株对三唑类杀菌剂丙环唑的敏感性，确定了稻瘟菌对丙环唑的敏感基线。为今后水稻田间抗药性监测提供了依据。同时测定了这53个稻瘟病菌菌株对丙环唑和其它杀菌剂的交互抗性。研究中还发现了2个对丙环唑超敏感的菌株，并对其超敏感现象的分子机理做了进一步的研究。 此外，本研究还利用农杆菌介导的ATMT转化技术筛选出稻瘟菌致病缺陷突变体Fy-1230，从中鉴定了T-DNA插入标记的基因MGG_09926，并对MGG_09926基因在调控稻瘟菌生长、分生孢子形成、有性生殖和致病性等方面的重要作用进行了研究。 一、水稻稻瘟菌对丙环唑的敏感性及与其它杀菌剂的交互抗性（一）稻瘟菌对丙环唑的敏感性供试的53个稻瘟病菌菌株对三唑类杀菌剂丙环唑的EC50值在0.145～1.446μg·mL-1之间，平均值为0.901μg·mL-1。将这些菌株的EC50平均值0.901μg·mL-1作为稻瘟病菌对丙环唑的敏感基线。发现菌株2004-006、07-82比其它51个菌株的EC50值小6倍以上（P<0.01）差异极显著，因此将菌株2004-006、07-82视为对丙环唑超敏感菌株，其它菌株为对丙环唑普通敏感菌株。 （二）稻瘟菌对多菌灵、三唑酮的敏感性所有测试的菌株对三唑类杀菌剂三唑酮的抑制中浓度EC50值在0.533～8.150μg·mL-1之间，超敏感菌株07-82、2004-006对三唑酮的EC50值比其它51个菌株的EC50值小7.5倍以上（P<0.01）差异极显著。53个菌株对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵的抑制中浓度EC50值在0.137～0.314μg·mL-1之间，超敏感菌株07-82、2004-006对多菌灵的敏感性与其它普通菌株相似，并没有明显差异，说明超敏感菌株07-82、2004-006对三唑类杀菌剂表现出超敏感性。稻瘟菌对丙环唑的EC50与稻瘟菌对多菌灵的EC50相关性分析表明：稻瘟菌对丙环唑与稻瘟菌对多菌灵的敏感性之间不具交互作用。 二、水稻稻瘟菌对三唑类杀菌剂超敏感性的分子机理（一）超敏感菌株与普通菌株遗传背景分析利用M13引物PCR指纹分析法对53个稻瘟病菌菌株基因组DNA进行PCR扩增。结果显示：超敏感菌株2004-006与其它菌株扩增出的条带有很大差异，但超敏感菌株07-82得出的条带与其它菌株条带具有很大的相似性，遗传背景一致。说明菌株07-82、2004-006对三唑类杀菌剂的超敏感现象不是由遗传背景的差异引起的。 （二）CYP51基因序列分析三唑类杀菌剂的靶标位点为CYP51（甾醇14-a-脱甲基酶或P45014DM），对CYP51基因序列分析发现，超敏感菌株07-82、2004-006的CYP51基因较普通菌株的CYP51基因分别发生了234、450位氨基酸序列改变。故由此推断这种氨基酸序列改变是引起稻瘟菌株07-82、2004-006对三唑类杀菌剂超敏感的原因之一。 （三）CYP51基因表达量分析分别提取超敏感菌株07-82、2004-006的RNA，mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行real-timePCR扩增，分析不同菌株CYP51基因表达量的差异。结果显示：超敏感菌株07-82、2004-006，普通菌株07-95、07-110的CYP51基因表达量的差异不明显（P>0.05）。说明菌株07-82、2004-006对丙环唑的超敏感现象不是由CYP51基因表达量的差异引起的。 三、稻瘟菌致病缺陷突变体的获得及T-DNA标记基因的鉴定（一）致病缺陷突变体利用农杆菌介导转化法（ATMT）筛选出一个对大麦和水稻都完全失去致病性的稻瘟病菌突变体Fy-1230。Fy-1230产孢显著下降，在正常的疏水表面不形成附着胞，菌落生长速率明显减慢，菌落颜色比野生型Guy11菌株的浅，有性生殖不能形成子囊壳。 （二）T-DNA标记基因的鉴定采用hiTAIL-PCR的方法，扩增了T-DNA右边界的1000bp左右的基因组DNA序列并克隆到pGEM-Teasy载体上。测序和BLAST分析结果显示，外源T-DNA插入了稻瘟病菌的MGG_09926基因内，该基因编码507个氨基酸。T-DNA插入位点距基因起始密码子751bp处。在NCBI上BLAST搜索得到与其高度同源性的氨基酸序列，与柄孢霉（Podosporaanserina）的XP_001908619序列有93%的相似性，与脉胞菌（Neurosporacrassa）的XP_958320序列、玉蜀黍赤霉（Gibberellazeae）的XP_381455序列都有90%的相似性。 四、突变体Fy-1230T-DNA单拷贝插入验证（一）单孢分离后潮霉素抗性检测将Fy-1230突变体子囊孢子单孢分离，所得到的30个单孢菌落接种到含有潮霉素的培养基上，16个菌落对潮霉素具有抗性，14个菌落对潮霉素不具有抗性，比例接近1：1。测定结果表明：T-DNA是单拷贝插入的。 （二）单孢菌落的致病性检测30个子囊孢子菌落所产生的分生孢予点滴接种于离体大麦叶片。16个不抗潮霉素菌落收集的分生孢子悬浮液接种大麦叶片，接种部位发病；14个抗潮霉素菌落收集的分生孢子悬浮液接种大麦叶片，接种部位不发病，不发病与发病比例接近1：1。实验结果表明：这个致病基因单拷贝存在于突变体基因组中。 五、Fy-1230突变体互补载体构建为了验证突变体Fy-1230的性状改变是由T-DNA插入MGG_09926基因引起的，构建了含有MGG_09926基因和绿色荧光蛋白基因GFP的融合载体Mg-GFP。设计引物扩增GFP基因和MGG_09926基因，得到的两个片段做连接反应，转化克隆，即得到互补载体Mg-GFP。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1文献综述

1.1稻瘟病概述

1.1.1稻瘟病与稻瘟病菌

1.1.2稻瘟病的发病规律

1.1.3稻瘟病菌的生活史

1.1.4稻瘟病菌的侵染循环过程

1.1.5稻瘟病菌的防治

1.1.6稻瘟病菌是丝状病原真菌分子生物学研究的模式

1.2三唑类杀菌剂的研究进展

1.2.1三唑类杀菌剂的种类与杀菌谱

1.2.2三唑类杀菌剂对作物生长的调节作用

1.2.3三唑类杀菌剂的抗药性

1.2.4三唑类杀菌剂的安全性及残留

1.2.5丙环唑及其靶标位点CYP51基因

1.3丝状真菌遗传转化的研究进展

1.3.1选择性标记

1.3.2转化载体

1.4根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)

1.4.1 ATMT在丝状真菌上应用的研究现状

1.4.2根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理

1.4.3根癌农杆菌介导丝状真菌转化的一般方法

1.4.4根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点

1.5绿色荧光蛋白研究进展

1.5.1 GFP的生化性质

1.5.2绿色荧光蛋白标记的优点

1.5.3 GFP基因标记的方式

1.6稻瘟菌致病相关基因的研究进展

1.6.1分生孢子形成相关基因

1.6.2附着孢发育相关基因

1.6.3与致病相关的胞内信号传导途径

2材料与方法

2.1实验室所用各类培养基、抗生素及工具酶

2.1.1培养基

2.1.2各类抗生素

2.1.3各类工具酶

2.1.4各类生化试剂、溶液及试剂盒

2.2常规分子生物学实验方法

2.2.1各类PCR反应

2.2.2DNA酶切

2.2.3酶切片段的去磷酸化(SAP)

2.2.4质粒DNA提取

2.2.5 DNA片段的凝胶回收

2.2.6连接反应

2.2.7大肠杆菌感受态细胞制备及细菌转化克隆

2.3稻瘟病菌对三唑类杀菌剂丙环唑的敏感性检测方法与材料

2.3.1试验材料

2.3.2供试菌株的活化

2.3.3药剂的配制

2.3.4稻瘟菌对丙环唑的敏感性测定

2.3.5丙环唑与其它杀菌剂的交互抗性

2.3.6菌落形态和致病性分析

2.3.6不同稻瘟病菌菌株DNA指纹图谱分析

2.3.6 CYP51基因DNA序列分析

2.3.7 CYP51基因表达量分析

2.4农杆菌介导的稻瘟病菌转化、致病突变体筛选材料与方法

2.4.1实验材料

2.4.2农杆菌介导的稻瘟菌T-DNA转化

2.4.3转化子的初步筛选及遗传稳定性检测

2.4.4表型分析

2.4.5突变体突变基因鉴定与序列分析

2.4.5突变体性状互补转化

2.5数据分析方法

3结果与分析

3.1稻瘟病菌对丙环唑的敏感性检测

3.1.1水稻稻瘟菌对丙环唑的敏感性

3.1.2稻瘟菌对丙环唑与稻瘟菌对多菌灵、三唑酮的交互抗性

3.1.3菌落形态

3.1.4致病性分析

3.1.5菌株遗传背景分析结果

3.1.6 CYP51基因序列的获得及分析

3.1.7 CYP51基因表达量分析

3.1.8讨论

3.2农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病突变体筛选

3.2.1致病缺陷突变体的获得

3.2.2突变体Fy-1230遗传稳定性检测

3.2.3菌落形态和生长速度分析

3.2.4分生孢子形态和产孢量

3.2.5有性生殖实验

3.2.6突变体Fy-1230的T-DNA侧翼DNA序列的扩增及克隆

3.2.7突变体Fy-1230 T-DNA标记基因的鉴定与分析

3.2.8突变体Fy-1230单孢分离、潮霉素抗性与致病性实验

3.2.9突变体Fy-1230互补载体的构建

3.2.10 讨论

3.2.11展望

4结论

4.1稻瘟菌对三唑类杀菌剂丙环唑的敏感性及超敏感现象的分子机理

4.1.1稻瘟菌对丙环唑、三唑酮及多菌灵的敏感性

4.1.2超敏感现象及其分子机理

4.1.3超敏感菌株、普通菌株生长速率及致病性

4.2农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体

4.2.1致病缺陷突变体Fy-1230

4.2.2突变体Fy-1230 T-DNA插入基因

4.2.3 MGG_09926基因功能

4.2.5突变体Fy-1230互补载体的构建

致 谢

参考文献：

个人简介

导师简介