SacB基因在紫花苜蓿中的转化和植株再生的研究及PCR扩增条件的确立

摘要

本研究以三个苜蓿品种（和田苜蓿、甘农3号和陇东苜蓿）为受体材料，采用农杆菌介导法进行SacB基因在苜蓿中转化的研究，并探索了转化植株再生条件及其再生过程中的褐化因素，筛选出卡那霉素抗性植株。进一步对转化组织进行了PCR检测，优化了PCR检测条件，确立了适宜的PCR扩增条件。主要研究内容及结果如下：
　　 1.建立了苜蓿三个品种基因转化体系。
　　 以和田苜蓿、甘农3号和陇东苜蓿的下胚轴为外植体，以农杆菌介导法为转化方法，进行了SacB基因的转化。系统研究了Kan对苜蓿组织生长的影响、Kan筛选时期和筛选浓度、菌液浓度、侵染时间及预培养时间。结果表明：Kan对苜蓿种子萌发的影响不显著：愈伤分化阶段是最适宜的筛选阶段，和田苜蓿、甘农3号、陇东苜蓿的选择压分别为80mg/L、60mgL、60mg/L。生根阶段，3个品种的Kan选择压分别为100mg/L、80mg/L、80mg/L。甘农3号、和田苜蓿、陇东苜蓿适宜的菌液的OD值分别为0.6、0.5和0.4。紫花苜蓿转化前不需要进行预培养，适宜的侵染时间为10min。
　　 2.分析探讨了转化组织在冬夏两季再生过程中出现的褐化现象，提出了相应的解决的办法。
　　 培养物的褐化程度具有季节性差异。2，4-D的最佳作用天数为15-20d，愈伤诱导、分化再生和生根阶段蔗糖的最佳浓度分别为30g/L、20g/L和10g/L。基因型影响培养物的褐化程度，褐化程度顺序为陇东苜蓿>和田苜蓿>甘农3号。培养温度冬季以恒温25℃为宜，夏季以白天23℃+黑夜21℃为宜。光照以3000Lux左右为宜。NAA的浓度在夏季应较冬季适当降低，IBA诱导生根适宜在冬季使用，生根率高，且褐化少。
　　 3.优化了PCR反应条件，对转化组织进行了PCR检测。
　　 对转化体进行PCR检测，结果表明：最佳引物为a组引物；最佳退火温度为52℃：25ul的反应体系中，dNTP、Mg2+、TaqDNA的最佳用量分别是2.0ul、2.5ul和0.4ul。在选取的50个抗性愈伤中，仅有1个愈伤为阳性愈伤，转化率为2％。