牧草内生枯草芽孢杆菌的功能多样性及其16S rDNA鉴定

摘要

植物内生细菌（Endophytic bacteria）是指定殖在植物组织内部但不引起明显病害症状的细菌。本研究应用传统微生物学和分子生物学相结合的研究方法，测定了4株内生枯草芽孢杆菌的促生、抑菌、固氮、溶磷、分泌生长素和分解纤维素等功能，研究了它们的主要生理特性，并利用16S rDNA技术对其进行了鉴定，主要结果如下：
　　 1.内生枯草芽孢杆菌生物学功能测定
　　 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XA7、XB3、ZA14和ZHC11菌株对大麦、茄子和番茄种子浸种处理后发芽率显著（显著水平F<0.01）高于对照，表明内生芽孢杆菌具有促进种子发芽的作用；对峙实验结果表明，4株菌对9种植物病原真菌均有抑制作用，如XB3对9种病原真菌的抑制率也各不相同，最大为32.3％，最小为15.6％；通过各菌株处理马铃薯干腐病菌菌丝和番茄早疫病菌菌丝72 h后，显微观察结果显示，各病菌菌丝出现膨大、扭曲现象，菌丝内的原生质发生凝集，菌丝顶端和中部出现泡状物且破裂，表明内生芽孢杆菌对测定的2种植物病原真菌具有致畸和破坏作用；4株菌具有分泌IAA能力，在不加色氨酸和加色氨酸的King培养基中，均为ZA14分泌IAA的浓度最高，其值分别为36.80μg/mL和25.74μg/mL，XA7最低，其值分别为1.58μg/mL和为3.84μg/mL；经过三代培养，4株菌均能在阿须贝培养基内明显生长，均具有固氮能力；4菌株在Pko平板培养基上形成溶磷圈，说明具有溶解[Ca3（PO4）2]的能力，但其溶磷能力较弱且差异不显著；4株菌在不同程度上具有分解纤维素的能力，从菌落周围形成的透明圈情况看，XB3的分解能力最强，其次是XA7、ZA14、ZHC11。
　　 2.内生枯草芽孢杆菌的培养特性
　　 枯草芽孢杆菌（Bacillus subglis）zA14、XA7、ZHC11和XB3分别在36h、48、60和72h生长量达到最大值；菌株.ZHC11在偏酸条件下（pH5）生长旺盛，菌株XA7、XB3和ZA14在pH6-8之间菌体生长旺盛，可见，不同内生枯草芽孢杆菌对酸碱的适应性有所不同；当NaCl浓度在0-7％之间时，各供试菌株均能生长，当NaCl浓度大于7％时，菌株XA7、ZHC11和XB3生长非常缓慢或停止生长，其中ZA14在NaCl浓度为9％时生长量（OD600）为0.148，说明ZA14具有较高的耐盐性。
　　 3.内生枯草芽孢杆菌的16S rDNA鉴定
　　 供试菌株在牛肉膏蛋白胨平板培养基和NB液体培养基上培养特征不同，革兰氏染色均呈阳性，但菌落形态差异明显；菌株XA7、XB3、ZA14和ZHC11经PCR扩增16S rDNA，测定的基因序列长度分别为：XA7（1514bp）、XB3（1452 bp）、ZA14（1451 bp）和ZHC11（1443bp），其序列与GenBaak中已报道的序列比较，构建系统发育数树，结合培养性状、染色反应测定结果，初步确定菌株XA7、XB3、ZA14和ZHC11均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。