海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒两种功能基因的克隆表达及其初步应用研究

摘要

病毒是海洋环境中丰度最高的一种生物体，平均密度高达106～109 VLPs/ml，高丰度的病毒形成了地球上潜在的基因多样性库。海洋病毒基因组携带了大量功能基因，但超过50％的病毒基因(CDS)功能尚末确定。海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒是迄今为止已报道的真核藻类病毒中基因组最大的病毒，其基因组中含有多种编码特定功能蛋白的基因，但目前对海洋藻类病毒特别是真核藻类病毒的功能基因研究甚少。本论文以海洋球石藻病毒EhV-99B1主要外壳蛋白(major caspid protein，MCP)及其基因组中的硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)基因为研究对象，从该病毒基因组中克隆两种功能基因，对其基因结构进行系统的生物信息学分析;在大肠杆菌中表达重组蛋白、制备其特异抗体;并就重组EhV-99B1 Trx在处理食品过敏原中的应用潜力以及EhV-99B1 MCP作为一种蛋白标记用于建立免疫荧光技术检测球石藻病毒感染率的可行性进行了初步研究和分析。 本研究从EhV-99B1基因组中克隆了Trx基因并对其结构特点进行了系统的生物信息学分析。采用限制性酶切法构建pGEX-4T-3/EhV-99B1-Trx重组表达载体并在大肠杆菌Origami宿主细胞中稳定表达，以GST-Sepharose4B树脂亲和层析法纯化重组Trx，对重组Trx的二硫键还原酶活性进行了分析。结果表明:(1) EhV-99B1 Trx基因的开放阅读框全长591bp，编码196个氨基酸，蛋白的相对分子量为22.1 kDa，理论等电点为5.27，亚细胞定位结果显示EhV-99B1 Trx可能为内质网分泌蛋白;(2) EhV-99B1 TrxN端蛋白结构域具有保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序;(3) EhV-99B1 Trx与GenBank中已报道的EhV-86 Trx(NC_007346)有很高的同源性，核酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为98％和100％。而与其他物种的Trx序列同源性仅为9.8％～18.8％;(4)该蛋白二、三级结构预测结果发现与其它生物体中已确定的Trx2更相似，氨基酸相似度为24.76％，从而证实EhV-99B1 Trx基因编码的是一种新型的硫氧还蛋白超家族成员;(5)对EhV-99B1 Trx的生物学功能分析预测结果表明可能与细胞分泌、免疫应答、抵御环境胁迫等相关;(6)重组EhV-99B1 Trx具有二硫键还原酶的活性，能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键及牛奶中β-乳球蛋白和酪蛋白的二硫键，有望开发成一种新型硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。同时，本研究结果也为进一步探讨该蛋白的结构、功能及自然海域中球石藻对环境胁迫（如病毒感染）的响应机理等奠定了基础。 从EhV-99B1中克隆了MCP全长片段，采用生物信息学方法和工具分析了EhV-99B1MCP蛋白的生化参数，预测了该蛋白的高级结构。采用限制性酶切法构建pGEX-4T-3/EhV-99B1-MCP重组表达载体并在大肠杆菌BL21宿主细胞中诱导表达，利用电洗脱方法纯化重组蛋白。同时，采用生物信息学方法预测EhV-99B1 MCP抗原表位，利用重叠延伸PCR技术拼接多个抗原表位，融合His标签在大肠杆菌BL21中表达，应用His·tag亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫BABL/c小鼠制备多克隆和单克隆抗体。结果表明:(1) EhV-99B1 MCP全长为1491bp，编码497个氨基酸，蛋白相对分子量为55kDa，理论等电点为6.34，亚细胞定位结果显示EhV-99B1 MCP为胞质蛋白;(2) MCP保守区域的同源性分析结果显示，EhV-99B1与EhV163(AF453851)分离株的同源性最高，核酸与对应推导的氨基酸序列同源性均为100％，与EhV203(AF453855)分离株的核酸及氨基酸序列的同源性较低，分别为93％和100％，基于EhVs外壳蛋白氨基酸保守区高度的同源性表明MCP可以作为一种蛋白检测标记，在自然海域中能够将EhVs与其他的藻类DNA病毒区分开来;(3)疏水性分析显示EhV-99B1 MCP为疏水蛋白质，从N端开始氨基酸序列中的43H-60Q;74D-94A;232L-288V;344N-366K;402P-431S;470L-493N等区域疏水性极强，推测这些区域可能与病毒包膜蛋白的相互作用有关;(4)EhV-99B1 MCP氨基酸序列中存在两个糖基化及多个磷酸化修饰位点，N端172至176位的PDFD及451至454位的SRLD为细胞凋亡信号转导途径中的特征蛋白酶-天冬氨酸特异性的半光氨酸蛋白水解酶caspase的特异性酶切位点;(5)EhV-99B1MCP抗原表位重组蛋白免疫小鼠效果较好，制备的多克隆抗体能很好的与纯化的EhV-99B1病毒颗粒特异性结合，因而选其进行下一步单克隆抗体的制备。该研究结果将为建立基于流式细胞仪(FCM)和荧光显微镜(FLM)的免疫荧光检测技术检测EhV的感染情况提供了方便。另外，纯化的重组EhV-MCP也可用于该病毒感染特性及其体外组装等研究。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 海洋原核藻类病毒-蓝藻病毒

1．2 海洋真核微藻类病毒

1．2．1 海洋真核微藻类病毒的研究概况

1．2．2 海洋真核藻类DNA病毒

1．2．3 海洋真核藻类RNA病毒

1．3 海洋球石藻病毒

1．3．1 海洋球石藻病毒的结构特点、分类及丰度

1．3．2 海洋球石藻病毒与宿主之间的相互作用关系

1．3．3 球石藻病毒基因特点及功能基因

1．3．4 球石藻及其病毒与生态环境的关系

1．4 本论文的研究目的与意义

第2章 重组海洋球石藻(E．huxleyi)病毒硫氧还蛋白的表达及其在处理食品过敏原中的应用

2．1 材料与方法

2．1．1 实验藻种、病毒株

2．1．2 实验试剂和基因工程载体

2．1．3 E．huxleyi的培养及病毒与宿主感染体系的建立

2．1．4 EhV病毒颗粒的纯化与浓缩

2．1．5 EhV9981 Trx基因的扩增

2．1．6 重组表达质粒的构建

2．1．7 重组质粒的诱导表达及蛋白纯化

2．1．8 重组pGEX-4T-3＼EhV-99B1-Trx Western Bloting检测

2．1．9 重组EhV-99B1 Trx二硫键还原酶活性测定

2．1．10 重组EhV-99B1 Trx对牛奶中二硫键蛋白的还原

2．2 实验结果

2．2．1 EhV-99B1 Trx基因的扩增及T克隆的构建

2．2．2 重组载体的构建及鉴定

2．2．3 EhV-99B1 Trx的生物信息学特征

2．2．4 EhV-99B1 Trx的原核表达、纯化及鉴定

2．2．5 重组EhV-99B1 Trx对胰岛素分子中二硫键的还原作用

2．2．6 重组EhV-99B1 Trx对牛奶中二硫键蛋白过敏原的脱敏作用

2．3 分析与讨论

2．3．1 海洋球石藻病毒EhV-99B1 Trx的结构特点

2．3．2 重组海洋球石藻病毒EhV-99B1 Trx对蛋白质二硫键的还原能力

第3章 球石藻病毒外壳蛋白的表达、抗体制备及其用于病毒感染的检测

3．1 材料与方法

3．1．1 实验藻种、病毒株

3．1．2 实验试剂、载体及溶液配制

3．1．3 E．huxleyi的培养及病毒与宿主感染体系的建立

3．1．4 EhV病毒颗粒的纯化与浓缩

3．1．5 EhV-99B1 MCP的生物信息学分析

3．1．6 EhV-99B1 MCP基因片段的扩增

3．1．7 重组表达质粒的构建

3．1．8 重组质粒的诱导表达及蛋白纯化

3．1．9 重组蛋白免疫动物实验

3．1．10 重组EhV-99B1 MCP的Western Bloting检测

3．2 实验结果

3．2．1 EhV-99B1 MCP生物信息学特征

3．2．2 EhV-99B1 MCP基因片段的扩增

3．2．3 重组表达质粒的构建及鉴定

3．2．4 EhV-99B1 MCP的表达、纯化及鉴定

3．2．5 EhV-99B1 MCP抗原表位的筛选及其免疫原性

3．3 分析与讨论

3．3．1 海洋球石藻病毒EhV-99B1 MCP的结构特点

3．3．2 海洋球石藻病毒EhV-99B1 MCP抗原表位及主要免疫功能区的特征

3．3．3 重组海洋球石藻病毒EhV-99B1 MCP的免疫原性及其作为诊断抗原的应用潜力

第4章 本论文的总结与创新点

4．1 本论文的研究总结

4．2 本论文的研究展望

4．3 本论文的创新点

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文