甘蔗渣降解菌的应用研究及其功能基因的克隆表达

摘要

海洋环境中含有丰富的微生物资源，基于技术等原因，只有少部分的海洋微生物被分离、研究及应用。由于生活环境不同于陆地，多数海洋微生物具有独特的生理生化及代谢功能，具有耐盐、嗜热、嗜冷等特征，可以说海洋环境比陆地蕴含更多极端微生物。深入研究海洋微生物，能够为人类获得更多的生物资源。
　　甘蔗渣是甘蔗制糖后的残留物，是一种生物质资源，主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，本研究采用原位富集方法，于近海及深海环境中富集甘蔗渣降解菌。首先利用分子生态学方法研究了两个富集位点下未培养甘蔗渣降解菌的菌群组成情况。结果显示两个文库均有各自较为明显的优势菌群:深海文库优势细菌类群为变形菌门，其中γ-变形菌纲在深海文库中的丰度最大;近海文库优势细菌类群为拟杆菌门。同时，从两个富集样品分离得到29株细菌，主要属于变形菌门与厚壁菌门两个类群，与未培养得到的优势菌群一致。
　　对从深海环境中分离到的两株芽孢杆菌GZ03、GZ04降解甘蔗渣的情况进行了分析，结果发现两株菌均能在甘蔗渣降解上具有应用价值:两个菌株能够降解甘蔗渣产较高浓度还原糖，离子色谱结果显示降解产物为葡萄糖、果糖混合液;通过GZ03菌株产还原糖单因素条件优化实验发现，菌株产还原糖最适培养基为2％甘蔗渣（60目）、3％NaCl、蒸馏水配置，产还原糖最适条件为:4％接种量、35℃摇床培养60 h;GZ04菌株采用固体发酵方法可降解甘蔗渣半纤维素，于28℃恒温发酵5d，半纤维素质量减少20％。
　　本研究也针对这两株菌一些参与甘蔗渣降解的酶类进行了研究。对菌株GZ03进行全基因组测序，分析测序结果，对其中编码果聚糖蔗糖酶基因GH5进行克隆表达。果聚糖蔗糖酶的最适水解温度为30℃，最适pH为6.0，最适蔗糖浓度为400 mM。果聚糖最适合成条件为:30℃、pH7.8、蔗糖浓度400 mM，并且在36h合成量最大。对GZ04菌株产的木聚糖酶进行酶学性质研究，发现该酶的最适温度为40。℃，最适pH值为5.0，在40℃环境下具有良好的稳定性，并且在不同pH环境下均能维持较高酶活力。
　　合理使用甘蔗渣，减少生产废料，实现蔗渣资源的可循环、可发展利用日益受到关注，而开发海洋来源的细菌降解甘蔗渣制糖是当前高效利用甘蔗渣的新途径。综上所述，本研究从海洋环境中分离得到两株芽孢杆菌均有潜在的应用价值，能够为合理使用甘蔗渣提供新思路，在利用海洋微生物降解甘蔗渣制糖应用上提供了理论依据，发掘了海洋微生物功能基因，为木质纤维的合理利用提供了更为广阔的研究及应用前景。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 海洋环境及其微生物研究进展

1．1．1 海洋环境简介

1．1．2 海洋微生物多样性及研究

1．2 微生物生态学研究方法

1．3 甘蔗渣的应用情况

1．4 微生物基因组学的研究

1．5 果聚糖蔗糖酶

1．5．1 Levan果聚糖简介

1．5．2 果聚糖蔗糖酶的概述

1．6 本研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 样品

2．1．2 菌株、质粒和引物

2．1．3 主要试剂与药品

2．1．4 实验所用溶液

2．1．5 培养基

2．1．6 主要仪器

2．1．7 主要分析软件

2．2 基本方法

2．2．1 提取细菌基因组DNA

2．2．2 PCR反应

2．2．3 化学转化法制备感受态细胞

2．2．4 质粒的化学转化

2．2．5 菌落PCR

2．2．6 质粒提取

2．2．7 从凝胶上回收DNA

2．2．8 SDS-PAGE电泳

2．2．9 甘蔗渣粉碎方法

2．2．10 DNS法测定葡萄糖、木糖的含量

2．2．11 苯酚-硫酸法测定总糖含量

2．2．12 蛋白质含量的测定

2．3 近海、深海原位富集下未培养甘蔗渣降解菌多样性研究

2．3．1 样品宏基因组DNA的提取

2．3．2 细菌16S rRNA基因克隆文库的构建

2．3．3 克隆文库多样性评价

2．3．4 系统发育树的构建

2．4 近海、深海原位富集下可培养甘蔗渣降解菌多样性研究

2．5 甘蔗渣降解菌降解甘蔗渣产糖情况研究

2．5．1 DNS法测定菌株降解甘蔗渣产还原糖情况

2．5．2 离子色谱法测定还原性单糖

2．6 Bacillus aryabhattai GZ03菌株降解甘蔗渣产还原糖单因素条件优化

2．6．1 发酵时间对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．2 营养源对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．3 NaCl浓度对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．4 温度对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．5 接种量对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．6 摇床转速对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．7 甘蔗渣浓度对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．6．8 甘蔗渣颗粒大小对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

2．7 Bacillus aryabhattai GZ03菌株全基因组测序

2．8 果聚糖蔗糖酶基因GH5异源表达及酶学性质研究

2．8．1 果聚糖蔗糖酶基因GH5表达引物的设计

2．8．2 果聚糖蔗糖酶基因序列及蛋白结构分析

2．8．3 基因组DNA的提取及基因GH5的PCR扩增

2．8．4 双酶切、连接及转化

2．8．5 菌落PcR验证

2．8．6 阳性转化子测序

2．8．7 测序结果分析

2．8．8 果聚糖蔗糖酶的诱导表达

2．8．9 含Histaq的重组蛋白的镍柱纯化

2．8．10 目的蛋白的SDS-PAGE检测

2．8．11 果聚糖蔗糖酶酶活力的测定

2．8．12 Levan果聚糖的分离纯化及结构鉴定

2．8．13 果聚糖蔗糖酶的酶学性质研究

2．8．14 Levan果聚糖合成条件的确定

2．9 Bacillus amyloliquefaciens GZ04菌株降解甘蔗渣半纤维素研究

2．9．1 半纤维素酶酶活测定

2．9．2 Bacillus amyloHquefaciens GZ04菌株半纤维素酶的酶学性质研究

2．9．3 甘蔗渣木质维素含量测定

2．9．4 甘蔗渣半纤维素的提取

2．9．5 Bacillus amyloliquefaciens GZ04菌株降解甘蔗渣半纤维素

2．10 统计分析

第3章 结果与分析

3．1 近海、深海原位富集下未培养甘蔗渣降解菌多样性分析

3．1．1 宏基因组DNA提取结果

3．1．2 PCR扩增16S rRNA

3．1．3 16S rRNA基因克隆文库的构建及阳性克隆测序

3．1．4 16S rRNA基因测序结果处理及文库多样性指数分析

3．1．5 16S rRNA基因系统发育树分析

3．2 近海、深海原位富集下可培养甘蔗渣降解菌多样性分析

3．2．1 可培养甘蔗渣降解菌的分离及初步鉴定

3．2．2 可培养甘蔗渣降解菌多样性分析

3．3 甘蔗渣降解菌降解甘蔗渣产糖情况分析

3．3．1 甘蔗渣降解菌降解甘蔗渣产还原糖情况分析

3．3．2 培养液中还原糖种类分析

3．4 单因素实验优化Bacillus aryabhattai GZ03菌株降解甘蔗渣产还原糖情况分析

3．4．1 发酵时间对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．2 添加营养源对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．3 NaCl浓度对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．4 温度对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．5 接种量对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．6 摇床转速对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．7 甘蔗渣浓度对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．4．8 甘蔗渣颗粒大小对Bacillus aryabhattai GZ03菌株产糖的影响

3．5 Bacillus aryabhattai GZ03菌株基因组学分析

3．5．1 基因组测序及组装结果

3．5．2 基因组注释

3．5．3 中心代谢途径

3．6 果聚糖蔗糖酶基因GH5异源表达及酶学性质

3．6．1 GH5基因序列及氨基酸序列分析

3．6．2 阳性重组子的菌落PCR及双酶切验证结果

3．6．3 果聚糖蔗糖酶GH5的诱导表达及纯化

3．6．4 Levan果聚糖结构测定

3．6．5 果聚糖蔗糖酶的酶学性质分析

3．6．6 Levan果聚糖合成条件研究

3．7 半纤维素酶的酶学性质分析

3．7．1 半纤维素酶的最适温度

3．7．2 半纤维素酶的最适pH

3．7．3 半纤维素酶的热稳定性

3．7．4 半纤维素酶的pH稳定性

3．8 菌株GZ04降解甘蔗渣半纤维素情况分析

第4章 讨论和总结

4．1 深海和近海原位富集样品甘蔗渣降解茵多样性分析

4．2 海洋中芽孢杆菌属的功能

4．2．1 Bacillus aryabhattai GZ03菌株的功能

4．2．2 Bacillus amyloliquefaciens GZ04菌株的功能

第5章 结论与展望

致谢

参考文献

附录

在学期间发表的学术论文