鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的底物特异性研究

摘要

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase，MBSP)是普遍存在于动物肌肉中的胰蛋白酶类似物。由于MBSP结构与功能间的作用缺乏深入研究，本文对鲫鱼MBSP的底物特异性进行分析，探讨并完善酶结构与功能间的关系，以拓展应用价值。
　　以鲫鱼MBSP为对象，利用基因重组构建8株突变酵母表达菌株SMD1168-pPICZαA-tMBSP，表达产物分别命名为D170S、D170T、D170K、S171A、G193A、G203A、D170T/G203A、G193A/G203A。利用本实验室制备的兔抗鲫鱼MBSP多克隆抗体进行Western blot鉴定，确认重组表达产物为鲫鱼MBSP。利用荧光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(BFSR)、Boc-Gln-Arg-Arg-MCA(BQRR)、Boc-Glu-Lys-Lys-MCA(BEKK)和Boc-Val-Leu-Lys-MCA(BVLK)进行酶活力测定，仅4个突变体具酶活力(S171A、G193A、G203A、G193A/G203A)。底物特异性研究结果表明，与野生型MBSP的最适底物BQRR相比，突变体G193A与G193A/G203A无明显变化;突变体S171A的最适底物同为BQRR，但仅能水解BQRR、BFSR，不能水解BVLK、BEKK;突变体G203A的最适底物变为BEKK，且明显偏向于切割含Lys残基的底物。
　　因突变体S171A专一的底物特异性，故对其进行深入分析。圆二色谱、同源建模结果显示，Ser171突变对MBSP的结构稳定性影响不大;分子对接分析结果显示，与野生型MBSP不同的是，底物BVLK、BEKK与突变体S171A的对接能量值由负值变为正值，且BVLK、BEKK作用区域彻底偏离酶分子的催化三联体与特异性底物结合口袋。由于底物与突变体S171A的作用区域发生变化最终导致突变体S171A只能选择性切割Arg残基，间接提示MBSP的催化三联体与特异性底物结合口袋在酶水解底物时发挥重要作用。
　　MBSP是使鱼糜制品发生凝胶劣化的原因之一。本文选择两种胰蛋白酶抑制剂对MBSP进行抑制动力学分析，结果显示两种抑制剂对MBSP的抑制关系均属于可逆的竞争型抑制。因此MBSP能够被胰蛋白酶抑制剂抑制，从而在鱼糜制品加工过程中缓解凝胶劣化现象。其次，比较分析MBSP与胰蛋白酶对全蛋白的酶解情况，发现拟穴青蟹主要过敏原均能被MBSP降解，包括耐胰蛋白酶消化的精氨酸激酶。相比于胰蛋白酶及野生型MBSP，突变型MBSP的消化速率最快，仅在1min就能将精氨酸激酶酶解成小分子片段。
　　综上所述，MBSP经分子改造后，其突变体结构稳定性不变。分子对接技术结果模拟出突变体S171A与底物的作用区域发生变化，而导致突变体S171A底物特异性的变化。本研究中MBSP表达量较高且热稳定性较好，制备较为容易，有望替代商品化的胰蛋白酶。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶

1．2 真核表达系统

1．3 蛋白酶分子改造

1．4 分子对接

1．5 本研究的目的和意义

2．1 材料

2．1．1 菌株及载体

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器设备

2．1．4 分析软件和网站

2．2 方法

2．2．1 毕赤酵母表达突变MBSP的菌株构建与重组表达

2．2．2 突变MBSP的酶学性质分析

2．2．3 突变MBSP的结构稳定性分析

2．2．4 突变MBSP与荧光底物的分子对接分析

2．2．5 突变MBSP的抑制动力学分析

2．2．6 突变MBSP对过敏原蛋白质的酶解分析

第3章 结果与分析

3．1 毕赤酵母表达突变MBSP的菌株构建与重组表达

3．1．1 MBSP的理性设计

3．1．2 突变MBSP的基因克隆与体外表达

3．1．3 突变MBSP表达产物的分析鉴定

3．2 突变MBSP的酶学性质分析

3．2．1 酶活力测定

3．2．2 最适温度和温度稳定性测定

3．2．3 最适pH和pH稳定性测定

3．2．4 底物特异性测定

3．2．5 动力学参数测定

3．2．6 半衰期参数测定

3．3 突变MBSP的结构稳定性分析

3．3．1 二级结构分析

3．3．2 三级结构分析

3．4 突变MBSP与荧光底物的分子对接分析

3．4．1 酶与底物分子结构文件的准备

3．4．2 酶与底物的分子对接

3．5 突变MBSP的抑制动力学分析

3．5．1 LBTI对MBSP的抑制作用

3．5．2 STI对MBSP的抑制作用

3．6 突变MBSP对过敏原蛋白质的酶解分析

3．6．2 胰蛋白酶与鲫鱼MBSP对精氨酸激酶的酶解分析

第4章 讨论

4．1 突变MBSP的重组表达与酶学性质分析

4．2 突变MBSP的结构稳定性分析

4．3 突变MBSP与荧光底物的分子对接分析

4．4 突变MBSP的抑制动力学分析及对过敏原的酶解分析

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

附录

在学期间科研成果情况