龟鹿二仙胶不同提取部位对体外培养豚鼠关节软骨细胞活性的影响

摘要

目的:
　　通过观察龟鹿二仙胶不同提取部位含药血清对豚鼠关节软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白黏多糖、Bcl-2及MMP-3的影响，从细胞、分子水平阐述龟鹿二仙胶不同提取部位对豚鼠关节软骨细胞的作用机制，筛选龟鹿二仙胶的有效部位，为龟鹿二仙胶新药的研发提供参考。
　　方法:
　　1.龟鹿二仙胶应用溶剂极性依次递增分离法，制备三氯甲烷、正丁醇、水提取物。
　　2.Wistar大鼠随机分组并分别用龟鹿二仙胶的3提取物连续灌胃7天后，采血制备含药血清。
　　3.采用三月龄豚鼠软骨细胞建立体外培养体系。
　　4.MTT比色法描绘各代豚鼠软骨细胞增殖生长曲线，确定各组含药血清干预时间。
　　5.应用免疫组化方法观察各组含药血清对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。
　　6.应用AB及PAS法观察各组含药血清对软骨细胞蛋白黏多糖表达。
　　7.应用RTF-QPCR法观察各组含药血清对软骨细胞bcl-2基因的表达。
　　8.应用ELISA法观察各组含药血清对软骨细胞MMP-3的表达。
　　结果:
　　1.甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性，提示成功建立豚鼠软骨细胞体外培养体系。
　　2.MTT比色法结果:各组含药血清干预软骨细胞48h促增殖药效最佳。
　　3.免疫组化结果:三种不同提取部位的含药血清表达均较对照组提高(P＜0.05)，醇提组＞水提组＞烷提组＞对照组(P＜0.05)。
　　4.高碘酸希尔染色(PAS)法结果:三种不同提取部位的含药血清阳性表达均较对照组提高(P＜0.05)，醇提组＞水提组＞烷提组＞对照组(P＜0.05)。
　　5.阿新兰染色法(AB)结果:三种不同提取部位的含药血清阳性表达均较对照组提高(P＜0.05)，醇提组＞水提组＞烷提组＞对照组(P＜0.05)。
　　6.荧光定量PCR结果:与对照组相比，三种不同提取部位的含药血清均能显著上调bcl-2基因的表达(P＜0.05);醇提组＞水提组＞烷提组＞对照组(P＜0.05)。
　　7.ELISA法结果:与对照组比较，三种不同提取部位的含药血清均能明显抑制MMP-3的表达(P＜0.05)，抑制MMP-3的效果为:醇提组＞水提组＞烷提组＞对照组(P＜0.05)。
　　结论:
　　龟鹿二仙胶主要提取物甾体类生物激素、多糖类和脂肪酸类物质能够不同程度促进豚鼠关节软骨细胞蛋白黏多糖、Ⅱ型胶原、bcl-2基因表达，抑制MMP-3的表达，从而提高豚鼠关节软骨细胞的活性，抑制软骨细胞的凋亡，其中醇提取部位药效最佳，水提取部位次之，提示龟鹿二仙胶的醇提取部位最有可能是其有效部位。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

实验内容

1 实验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

1．3 实验动物

1．4．实验药材

2．实验方法

2．1 龟鹿二仙胶三氯甲烷、正丁醇、水提取部位的制备

2．2 龟鹿二仙胶三氯甲烷、正丁醇、水提取部位含药血清的制备

2．3 豚鼠关节软骨细胞体外培养体系的建立

2．4 MTT比色法描制豚鼠关节软骨细胞生长曲线及各组含药血清干预的最佳时间

2．5 AB、PAS染色检测各组含药血清对豚鼠关节软骨细胞GAG合成的影响

2．6 免疫组化染色检测各组含药血清对豚鼠关节软骨细胞Ⅱ型胶原合成的影响

2．7 荧光定量法检测各组含药血清对豚鼠关节软骨细胞bcl-2基因表达的影响

2．8 Elisa检测各组含药血清对豚鼠关节软骨细胞MMP-3分泌的影响

2．9 统计学分析

2．10．技术路线图

3．实验结果

3．1 龟鹿二仙胶不同提取部位含药血清的制备

3．2 倒置显微镜下观察各代软骨细胞生长情况

3．3 软骨细胞鉴定结果

3．4 MTT法描绘各代豚鼠软骨细胞生长曲线

3．5 各组含药血清对软骨细胞增殖的影响

3．6 各组含药血清对软骨细胞Ⅱ型胶原的表达的影响

3．7 各组含药血清对豚鼠软骨细胞中性黏多糖的表达的影响

3．8 各组含药血清对豚鼠关节软骨细胞酸性黏多糖的表达的影响

3．9 各组含药血清对豚鼠软骨细胞BCL-2的表达影响

3．10 各组含药血清对豚鼠软骨细胞分泌MMP-3的的影响

4．讨论

4．1 中医对OA的认识及龟鹿二仙胶的相关研究概况

4．2 以豚鼠关节软骨细胞为研究对象的原因

4．3 含药血清用于细胞实验研究现状

4．4 关节软骨细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定

4．5 MTT法描绘豚鼠关节软骨细胞生长曲线

4．6 Ⅱ型胶原、蛋白黏多糖、Bcl-2、MMP-3与关节软骨细胞活性的关系

4．7 龟鹿二仙胶不同提取部位的含药血清对豚鼠关节软骨细胞活性的影响

5．结论

6．本研究不足与展望

参考文献

致谢

文献综述 中药干预软骨细胞代谢的实验研究进展

作者简历