补肾活血汤促进兔激素性股骨头缺血坏死修复机制的研究

摘要

目的:
　　通过补肾活血汤对激素性股骨头缺血坏死兔模型的干预，观察其对股骨头内主要成分含量、骨生物力学的影响，并检测骨组织中wnt/β-catenin信号通路上成骨和成脂相关因子基因和蛋白的表达，由此来探讨补肾活血汤防治激素性股骨头缺坏死兔模型的机制。
　　方法:
　　6月龄新西兰大白兔104只，随机分成空白组26只，造模组78只。造模组采用贺氏造模法建立激素性股骨头缺血坏死兔模型，经HE染色进行模型鉴定。将造模成功的53只大白兔，随机分成模型组27只和治疗组26只。鉴定造模成功1周后，3组动物进行灌胃，治疗组用补肾活血汤5.05 g/kg/d，每天分早晚两次在相同时间灌胃，连续8周，模型组和空白组采用等量的生理盐水进行灌胃，时间一致。在干预满6周和8周时，分别处死一半兔子，取右侧股骨头检测生物力学指标（弹性模量、最大载荷、应变能力）和股骨头主要成分含量（钙和羟脯氨酸）。用RT-PCR和Western Blot方法检测左侧股骨头Wnt/β-catenin信号通路上成骨和成脂相关因子的基因和蛋白表达。比较蛋白同组间6周和8周时，3组间6周和3组间8周时以上各指标的变化与联系;比较基因6周时3组间的变化。
　　结果:
　　1.光镜观察
　　空白组软骨层较厚，软骨细胞数量正常;骨小梁完整，排列规则，形态正常;偶见空骨陷窝;骨髓腔内造血细胞丰富，脂肪细胞较少。模型组软骨细胞大量减少、软骨层变薄甚至缺损;骨髓腔内填充大量的脂肪细胞，脂肪细胞增大或互相融合成大泡;骨髓造血细胞减少，部分造血细胞核碎裂、核溶解，部分骨细胞固缩或消失、骨陷窝空虚多见;骨小梁变细、稀疏、连续性中断、散乱，部分骨小梁出现坏死。
　　2.空骨陷窝率
　　与模型组相比，空白组空骨陷窝率较低，为（10.06±0.13）％;模型组明显增高，为（29.68±1.23）％;两者有显著性差异P＜0.01。
　　3.股骨头主要成分含量检测
　　3.1 骨羟脯氨酸含量:6周与8周比较，空白组、模型组、治疗组三组间均无差异(P＞0.05)。6周、8周时的趋势:空白组＞治疗组＞模型组。8周和6周比较，空白组、治疗组明显增高，模型组略有增高。其中，空白组与模型组比较，6周、8周都有统计学意义（P＜0.05）;模型组与治疗组比较，6周有统计学意义（P＜0.05），8周有显著的统计学意义（P＜0.01）。其余各组间无差异。
　　3.2 骨钙含量:6周与8周比较，空白组、治疗组组间均无差异（P＞0.05），模型组间有统计学意义(P＜0.05)。6周和8周趋势:空白组＞治疗组＞模型组;空白组和治疗组明显增高，模型组明显降低。空白组与模型组比较，6周(P＜0.01)、8周（P＜0.05）有统计学意义;模型组与治疗组比较，6周（P＜0.05）、8周（P＜0.01）有统计学意义。
　　4.股骨头生物力学检测
　　4.1 骨材料力学指标:弹性模量比较6周、8周趋势:空白组＞治疗组＞模型组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。6周和8周比较，模型组有统计学意义（P＜0.05）。6周时，空白组与模型组、模型组与治疗组比较，均有统计学意义(P＜0.05)。8周时，空白组与模型组比较，有统计学意义(P＜0.05);模型组与治疗组比较，有显著统计学意义（P＜0.01）。
　　4.2 骨结构力学指标:应变能力6周时:空白组＞治疗组＞模型组，组间差异有显著统计学意义(P＜0.01);8周时:空白组＞治疗组＞模型组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，空白组与模型组比较，6周、8周有显著的统计学意义（P＜0.01）;模型组与治疗组比较，6周、8周有统计学意义（P＜0.05）。6周和8周比较，空白组明显增高，模型组略增高，治疗组略降低。
　　最大载荷值6周和8周趋势:治疗组＞模型组、空白组＞模型组，组间差异均有显著的统计学意义（P＜0.01）;空白组和治疗组明显增高，模型组明显降低;模型组间有统计学意义（P＜0.05）。空白组与模型组比较，6周(P＜0.01)、8周（P＜0.05）有统计学意义:治疗组与模型组比较，6周（P＜0.05）、8周（P＜0.01）有统计学意义。
　　5.Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达:①和模型组相比，空白组和治疗组中成骨相关蛋白Wnt11、sFRP2、FZD6、Ror2的表达升高，随时间延长增强效果呈略升趋势;wnt9a的表达下降，随时间延长呈下降趋势。sFRP3只在8周时空白组和模型组间统计学比较有意义。sFRP2到8周时组间才有意义。wnt11和wnt9a只在6周时组间有意义，8周则没有意义。FZD6和Ror26周和8周时组间统计学都有意义。②和模型组相比，空白组和治疗组中成脂相关蛋白DKK1、sFRP4、Wnt5b的表达明显下降，wnt10b、β-catenin的表达升高。Wnt10b到8周时组间才有意义。β-catenin和sFRP4只在6周时组间有意义。在6周和8周时，DKK-1和Wnt5b组间都有意义，Wnt1无意义。
　　6 Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达:①6周时和模型组相比，空白组和治疗组中成骨相关因子Wnt11、sFRP2、Ror2和FZD6的表达明显升高，wnt9a的表达明显下降;sFRP3组间比较无意义。②6周时和模型组相比，空白组和治疗组中成脂相关基因DKK-1、sFRP5、Wnt1、Wnt5b的表达明显降低，wnt10b、β-catenin的表达升高。sFRP4组间比较无意义。
　　结论：
　　1.补肾活血汤能调节体内钙磷代谢紊乱状态，加速基质合成，提高股骨头的强度;增强骨的应变能力和最大载荷值，提高骨的弹性模量，改善骨质疏松状态，使骨在结构力学和材料力学方面得到了重塑与稳定。
　　2.补肾活血汤调控股骨头内骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化的机制主要是通过增强Wnt/β-catenin信号通路中成骨因子Wnt11、sFRP2、Ror2和FZD6的基因和蛋白表达，抑制wnt9a的表达;同时抑制成脂因子DKK-1、Wnt5b的表达，促进wnt10b和β-catenin的表达，从而抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞转化，促进其向成骨细胞转化，加快坏死骨组织修复。

目录

声明

摘要

前言

第一章 建立激素性股骨头缺血坏死兔模型并鉴定

1 研究目的

2 实验材料

2．1 实验动物、实验药品

2．2 实验试剂及仪器

2．3 实验试剂配制

3 实验方法

3．1 实验动物分组及造模

3．2 免股骨头坏死模型的鉴定

3．3 统计学处理

4 结果

4．1 动物一般情况观察

4．2 组织光镜观察结果

5 讨论

5．1 现有模型制备的方法

5．2 现有模型的动物选择

5．3 本造模法的评价

5．4 关于降低造模动物死亡率的方法

第二章 补肾活血汤对兔激素性股骨头缺血坏死生物力学观察

1 研究目的

2 实验材料及方法

2．1 主要试剂及仪器

2．2 实验方法与步骤

2．3 统计学处理

3 结果

3．1 材料力学

3．2 结构力学

4 讨论

4．1 SANFH的骨质疏松学说

4．2 各组骨生物力学的差异

第三章 补肾活血汤对兔激素性股骨头缺血性坏死股骨头主要成分含量的影响

1 实验目的

2 实验材料

2．1 主要实验试剂和仪器

2．2 实验耗材

3 实验方法与步骤

3．1 羟脯氨酸含量测定

3．2 钙含量测定

3．3 统计学处理

4 结果

4．1 羟脯氨酸测定结果

4．2 钙含量测定结果

5 讨论

5．1 骨的组成

5．2 羟脯氨酸与骨的关系

5．3 钙与骨代谢的关系

5．4 本实验结果

第四章 补肾活血汤对兔激素性股骨头缺血性坏死Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白和基因表达的影响

1 研究目的

2 实验材料

2．1 实验主要试剂及仪器

2．2 实验耗材

3 实验方法

3．1 补肾活血汤对免激素性股骨头缺血性坏死Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

3．2 补肾活血汤对兔激素性股骨头缺血性坏死wnt／β-catenin信号通路相关基因表达的影晌

3．3 统计学处理

4 结果

4．1 蛋白各指标灰度图

4．2 各指标蛋白条带数据分析结果

4．3 总RNA的纯度和浓度测定

4．4 股骨头各基因mRNA表达的差异结果分析

5 讨论

5．1 激素性股骨头缺血坏死与骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化的相关性

5．2 Wnt信号通路概况

5．3 Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与分化的影响

5．4 本实验结果

结论

不足和展望

参考文献

附录

致谢

文献综述

作者简历