狗脊多糖对软骨细胞增殖及氧自由基影响的实验研究

摘要

目的：
　　本研究旨在观察狗脊多糖对体外培养大鼠软骨细胞增殖和氧自由基的影响，为其在骨关节炎的临床应用提供理论依据。
　　方法：
　　1、本实验用水提醇沉、Sevag法除蛋白提取纯化获得狗脊多糖，通过苯酚-硫酸比色法测定狗脊多糖含量。
　　2、采用机械-酶消化法分离SD大鼠膝关节的软骨细胞，建立体外培养并鉴定软骨细胞，使用倒置显微镜镜下观察软骨细胞形态;MTT法检测狗脊多糖对软骨细胞增殖特性的影响;流式细胞术检测经狗脊多糖干预的软骨细胞周期变化的影响;RT-PCR、WesternBlot分别检测软骨细胞周期相关基因与蛋白的表达;酶联免疫吸附测定法分别检测软骨细胞液中SOD、NO、MDA的含量。
　　结果：
　　1、狗脊多糖含量为76.91％，精密度实验RSD=1.86％，表明仪器精密度良好，且稳定性试验RSD=1.98％，平均回收率试验为95.4％，RSD=1.83％。
　　2、第2代软骨细胞形态一致、胞核可视且清晰，生长状态良好;经甲苯胺蓝染色鉴定其胞核为蓝色;经Ⅱ型胶原染色后，阳性对照组胞浆区呈棕黄色。
　　3、MTT实验结果显示，狗脊多糖对软骨细胞增殖具有一定的时效-量效关系，其最佳干预时间和浓度分别为48 h和200μg/ml;流式细胞术检测结果显示，与空白组比较，各实验组(100;200;400μg/ml)干预48 h后，以200μg/ml组在G0/G1期所占细胞比例最低(P＜0.01)，在S期最高(P＜0.01); RT-PCR及Western Blot法检测结果显示，各实验组(100;200;400μg/ml)干预48 h后，CDK4、Cyclin D1、pRB的mRNA与蛋白表达均高于空白组，且以200μg/ml组表达最显著(P＜0.01)。
　　4、酶联免疫吸附法检测结果显示，与正常组相比，模型组SOD、NO、MDA含量表达均有统计学意义(P＜0.01)，提示模型建立;与造模组相比，各实验组(100;200;400;800μg/ml)干预48 h，可上调SOD、下调NO、MDA含量表达，其中以200μg/ml组表达最显著(P＜0.01)。
　　结论：
　　1、狗脊多糖对软骨细胞增殖作用具有一定的时效-量效关系，其促增殖机制为通过提高软骨细胞周期中G1至S的转变率，并上调正性调控因子的基因与蛋白含量的表达。
　　2、狗脊多糖可降低经硝普钠造模后软骨细胞中异常氧自由基含量表达，上调抗氧化因子水平，发挥抗氧化作用。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要实验用液配制

2 实验方法

2．1 狗脊多糖的提取

2．2 苯酚-硫酸比色法检测狗脊多糖的含量

2．3 软骨细胞的分离和培养及鉴定

2．4 退变软骨细胞模型的复制

2．5 MTT比色试验测定软骨细胞增殖活性

2．6 流式细胞仪检测CBPS干预软骨细胞周期分布特点

2．7 RT-PCR法检测Cyclin D1、CDK4、pRB mRNA表达

2．8 Western Blot检测Cyclin D1、CDK4、pRB蛋白含量表达

2．9 酶联免疫吸附测定法测试SOD、NO、MDA的含量

3 统计学分析

结果

1 苯酚-硫酸比色法检测结果

2 软骨细胞形态学特征及鉴定

3 狗脊多糖对软骨细胞增殖的时效与量效关系

4 流式细胞术检测结果

5 RT-PCR及Western Blot检测结果

6 酶联免疫吸附测定法检测结果

讨论

1 狗脊与中药多糖

2 狗脊多糖干预骨关节炎的机制

结论

参考文献

致谢

文献综述 补肾活血法干预骨关节炎的机制研究

作者简历