TMEM49在卵巢癌组织中表达的临床意义及对卵巢癌发生及转移中的作用机制

摘要

目的：
　　在中国，卵巢癌是女性前十大常见肿瘤，在女性生殖系统常见恶性肿瘤中发病率位居第三，死亡率却仅次于宫颈癌。原因是卵巢癌发病隐匿、转移前常无症状，大多数卵巢癌患者确诊时即处于癌症晚期，错过了最佳的治疗时机。因此，寻找卵巢癌特异性相关基因，为卵巢癌的诊断和治疗提供新的理论依据，成为卵巢癌早期诊疗的关键。
　　为此，国内外大量研究致力于寻找卵巢癌相关特异性基因。TMEM(TransmembraneProtein，跨膜蛋白)作为膜蛋白的一部分，参与了细胞的信号传导和增殖分化等，是肿瘤相关基因研究热点之一。TMEM家族里大部分作为癌基因，如TMEM16a、TMEM17a、TMEM17b等，也有作为抑癌基因发挥功能，如TMEM100等。
　　TMEM49在不同肿瘤中的作用已有相关文献报道，但它与卵巢癌之间的关系尚未明确。本研究以TMEM49作为目标基因，应用免疫组织化学的方法进一步研究其在卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达情况，探讨其表达的临床意义。并通过RNA干扰技术研究TMEM49对卵巢癌株系生物学行为的影响，探测其与卵巢癌发生、发展、转移等的相关性，并揭示其在癌症发生过程中的分子机制及探讨其作为卵巢癌诊断和治疗靶点的可能性。
　　方法：
　　应用免疫组织化学方法检测卵巢癌组织和正常组织各30例的TMEM49的表达情况。分别采用蛋白免疫印迹方法和实时定量PCR检测5株卵巢癌细胞系中TMEM49蛋白和mRNA水平的表达，选择高表达的卵巢癌株系构建TMEM49-ShRNA稳定转染的细胞系，通过细胞增殖实验、流式周期和凋亡实验、细胞侵袭粘附实验等方法分析TMEM49对卵巢癌株系生物学行为的影响。并通过PCR和Western blot方法检测卵巢癌细胞系中TMEM49基因干扰凋亡通路Caspase3、Bad、Bax及转移通路MMP2、KLF10、CXCL12等的表达差异。
　　结果：
　　1.TMEM49在卵巢癌组织中表达率比正常卵巢组织高，差异具有统计学意义(P＜0.05);
　　2.卵巢癌组织中TMEM49的表达与FIGO分期、组织学分级有关(P＜0.05)。FIGO分期或组织学等级越高，TMEM49表达阳性率越高;
　　3.TMEM49 ShRNA下调TMEM49的表达可减慢卵巢癌细胞A2780的增殖速度，阻滞细胞G1/S期转化，诱导其细胞凋亡，并降低侵袭能力和粘附能力，差异均具有统计学意义（P＜0.05);
　　4.TMEM49 ShRNA可上调凋亡通路的相关基因如Caspase3、Bad、bax的表达，却下调转移通路MMP2、KLF10、CXCL12的表达（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.TMEM49在卵巢癌中高表达，并与卵巢癌FIGO分期、组织分化程度正相关，这可能与TMEM49高表达参与了卵巢癌的发生进展有关。
　　2.干扰TMEM49表达可降低卵巢癌细胞的增殖、侵袭和粘附能力，阻滞细胞G1/S期转化，并诱导细胞凋亡，这表明TMEM49促进卵巢癌的发生发展，提示TMEM49可以作为卵巢癌治疗的一个潜在基因靶点。
　　3.干扰TMEM49的表达可引起细胞凋亡通路Caspase3、Bad、bax表达的上调，以及下调转移通路MMP2、KLF10、CXCL12的表达，这提示TMEM49可能是通过抑制细胞凋亡通路及转移通路来促进卵巢癌的进展。

目录

声明

摘要

前言

TMEM49在卵巢癌中的表达及临床意义

1 实验材料

1．1 研究标本的选择和收集

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 实验步骤

2．2 染色结果判读

2．3 统计学方法

3 实验结果

3．1 TMEM49在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的细胞定位及表达情况

3．2 TMEM49在卵巢癌中的表达与临床病理特征的关系分析

4 讨论

5 结论

下调TMEM49对卵巢癌细胞的生物学行为影响

1 实验材料

1．1 细胞株和质粒来源

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 细胞培养及质粒提取

2．2 构建能够稳定转染的卵巢癌细胞系

2．3 Western-blot法确定TMEB49及相关基因的表达

2．4 实时定量PCR检测mRNA的表达

2．5 Cell Counting Kit-8检测细胞增殖实验

2．6 流式细胞术检测细胞周期

2．7 Annexin V-FITC／PI双染法检测细胞凋亡

2．8 Transwell实验检测细胞侵袭能力

2．9 细胞粘附实验检测细胞粘附能力

2．10 统计学方法

3 实验结果

3．1 Western-blot法检测相关蛋白的表达情况

3．2 实时定量PCR从mRNA水平检测TMEM49及相关基因的表达

3．3 下调TMEM49表达可抑制卵巢癌细胞的增殖

3．4 下调TMEM49表达可阻止卵巢癌细胞周期进程

3．5 干扰TMEM49的表达可促进细胞凋亡

3．6 干扰TMEM49表达可降低卵巢癌细胞的侵袭及粘附能力

3 讨论

4 结论

总结

参考文献

附录

致谢

文献综述 TMEM家族与肿瘤关系的研究进展

作者简历