基于miRNAs介导突触可塑性探讨电针改善缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆功能的作用机制

摘要

目的：
　　探讨电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆功能以及静息态功能磁共振成像（resting-state functional magnetic resonance imaging，rs-fMRI）的影响。在神经影像学的基础之上，探讨脑区突触结构和功能的可塑性变化，并进一步基于microRNA(miRNA)组学探讨其分子生物学机制。
　　方法：
　　1.根据随机数字表法:将SPF级雄性sprague dawley(SD)大鼠随机分为假手术组和缺血性脑卒中造模组，然后依据干预前神经功能缺损评分和行为学结果将大鼠随机分为3组，模型组、电针组和非穴组。
　　2.复制缺血性脑卒中大鼠模型，术后第2天开始取“百会”、“神庭”穴及非经非穴实施电针干预，电压峰值为6V，疏密波，频率2/20 Hz，每次治疗30min，1次/天，共14天;
　　3.干预前后各组大鼠采用跳台实验检测其学习记忆功能;干预后采用Morris水迷宫检测其空间学习记忆能力;
　　4.采用小动物rs-fMRI扫描以及脑区BOLD信号局部一致性(regional homogeneity，ReHo)分析各组大鼠神经细胞活动变化;
　　5.采用高尔基染色(Golgi)观察各组大鼠神经突触和树突棘形态变化，以及场电位电生理检测各组大鼠长时程增强（long-term potentiation，LTP）反应;
　　6.采用Western blotting法检测学习记忆相关蛋白的表达和磷酸化水平;
　　7.采用miRNA芯片检测miRNAs的差异表达，以及靶基因预测和信号转导通路分析，实时荧光定量PCR法验证miRNA表达水平。
　　结果：
　　1.本研究发现干预前，模型组、电针组和非穴组跳台实验观察的学习记忆行为学三组之间无统计学差异(P＞0.05);干预后，电针组相对模型组、非穴组大鼠跳台实验和Morris水迷宫观察的潜伏期缩短(P＜0.05)。
　　2.采用T2WI发现缺血性模型大鼠海马、内嗅皮层、运动皮层、感觉皮层、背侧丘脑和纹状体等脑区出现梗死，而电针“百会”、“神庭”穴减少其脑区梗死体积(P＜0.05);
　　3.对各组大鼠进行rs-fMRI分析，发现缺血性脑卒中模型大鼠BOLD信号局部一致性降低的脑区包括双侧杏仁核、双侧海马、双侧内嗅皮层、双侧岛叶皮层、双侧梨状皮质、双侧感觉皮层、双侧运动皮层、双侧扣带回、双侧背侧丘脑、左侧听觉皮层和左侧纹状体(P＜0.005)。而电针干预后双侧杏仁核、双侧海马、右侧岛叶皮层、双侧内嗅皮层、右侧梨状皮层和右侧感觉皮层BOLD信号局部一致性升高(P＜0.005);非穴干预后左侧杏仁核、左侧梨状皮质和左侧纹状体BOLD信号局部一致性升高(P＜0.005);
　　4.选择学习记忆相关脑区海马CA1、内嗅皮层进一步分析其突触可塑性变化，低倍视野下显示缺血性脑卒中模型大鼠海马CA1、内嗅皮层树突棘脱落、萎缩，排列紊乱;而电针治疗后其病理损伤程度缓解。高倍视野下电针治疗后缺血性脑卒中模型大鼠树突棘的分支、数量和密度均增加（P＜0.05）;
　　5.突触功能可塑性检测发现缺血性脑卒中模型大鼠在HFS诱导后缺血侧海马CA3-CA1和内嗅皮层-海马CA1的兴奋性突触后电位(fEPSP)斜率的百分比均下降(P＜0.05);而电针治疗后其fEPSP斜率的百分比增加(P＜0.05)，突触后膜相关学习记忆蛋白AMPA受体、NMDA受体的磷酸化水平升高(P＜0.05);
　　6.缺血侧海马CA1和内嗅皮层进行miRNA芯片分析显示:缺血侧海马CA1差异表达≥1.5 miRNAs共48个miRNAs(P＜0.05)，其中36个miRNAs表达下调，12个miRNAs表达上调;缺血侧内嗅皮层差异表达≥1.5 miRNAs共90个(P＜0.05)，其中70个miRNAs表达下调，20个miRNAs表达上调;其中rno-miR-668和rno-miR-3084b-5p在缺血侧海马CA1和内嗅皮层均表达上调;而rno-miR-28，rno-miR-10a，rno-miR-let-7b，rno-miR-425，rno-miR-7b，rno-miR-154，rno-miR-540,rno-miR-let-7f-2，rno-miR-186，rno-miR-219a，rno-miR-3072，rno-miR-344a,rno-miR-190b，rno-miR-100，rno-miR-92a的表达水平在两个脑区均下调;
　　7.对以上缺血侧海马CA1和内嗅皮层表达均上调和下调的miRNAs进行靶基因预测和信号转导通路分析，发现富集分高的cGMP-PKG信号通路(P＜0.05)与学习记忆功能密切相关，通过生物信息学预测和体外证实miR-219a负调控cGMP-PKG信号通路关键节点PRKG2靶基因(P＜0.01);
　　8.对miR-219a进行在体功能分析，发现miR-219a mimics可以阻断电针“百会”、“神庭”穴下调miR-219a的表达水平，并影响PRKG2下游CREB的磷酸化，进而减少学习记忆即刻早期基因c-fos和c-jun的蛋白表达(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.电针“百会”、“神庭”穴治疗缺血性脑卒中模型大鼠14天，提高大鼠学习记忆能力，减少海马、内嗅皮层的梗死体积，增强海马、内嗅皮层BOLD信号局部一致性，提示脑卒中模型大鼠学习记忆能力的改善与海马、内嗅皮层结构和功能损伤的修复相关。
　　2.电针“百会”、“神庭”穴促进缺血性脑卒中模型大鼠缺血侧海马、内嗅皮层树突棘形态的修复和易化海马CA3-CA1和内嗅皮层-海马CA1的LTP反应，促进突触结构和功能的可塑性。
　　3.电针“百会”、“神庭”穴抑制脑卒中模型大鼠miR-219a的表达，上调靶基因PRKG2，促进下游CREB的磷酸化，从而促使学习记忆相关蛋白c-fos和c-jun的合成。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

第一部分 电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆能力及脑区BOLD信号局部一致性的影响

1 材料

2 方法

2．1 实验分组

2．2 模型制备

2．3 干预措施

2．4 神经功能缺损评估

2．5 学习记忆行为学评估

2．6 脑梗死观察及其体积测量

2．7 静息态脑功能观察

2．8 统计学分析

3 结果

3．1 电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠神经缺损功能的影响

3．2 电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆行为学的影响

3．3 电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠脑梗死部位和体积的影响

3．4 电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠脑区BOLD信号的影响

4 讨论

第二部分 电针“百会”、“神庭”穴对缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆相关脑区突触可塑性的影响

1 材料

2 方法

2．5 高尔基染色观察

2．6 电生理检测

2．7 Western blotting检测学习记忆相关蛋白的表达

2．8 统计学分析

3 结果

3．1 电针对缺血性脑卒中模型大鼠海马CA1和内嗅皮层突触形态的影响

3．2 电针对缺血性脑卒中模型大鼠海马和内嗅皮层LTP的影响

3．3 电针对缺血性脑卒中模型大鼠海马CA1和内嗅皮层学习记忆相关蛋白的影响

4 讨论

第三部分 电针“百会”、“神庭”穴介导miRNAs调控缺血性脑卒中模型大鼠学习记忆相关蛋白的表达

1 材料

2 方法

2．1 实验分组

2．2 实验造模

2．3 药物注射

2．6 miRNA芯片检测

2．7 定量PCR检测miRNA的表达

2．8 靶基因预测和信号转导通路预测

2．9 双荧光素酶报告载体构建与转染

3．1 电针对缺血性脑卒中模型大鼠缺血侧海马CA1和内嗅皮层miRNAs表达的影响

3．2 miRNAs表达的验证

3．3 miRNAs靶基因预测及其信号转导通路分析

3．4 体外实验验证miR-219a与PRKG2的相互作用关系

3．5 电针调控miR-219a对模型大鼠cGMP-PKG信号转导通路关键节点表达的影响

3．6 电针调控miR-219a对模型大鼠学习记忆即刻早期基因蛋白表达的影响

4 讨论

结论

不足与展望

参考文献

附录

文献综述 针刺改善脑卒中后认知功能和突触可塑性的研究进展

致谢

作者简历