透骨消痛胶囊调控miRNAs抑制骨关节炎软骨基质稳态失衡的机制研究

摘要

目的：
　　探讨透骨消痛胶囊调控miRNAs抑制骨关节炎软骨基质稳态失衡的作用机制。
　　方法：
　　1.2月龄SPF级SD雄性大鼠30只，随机数字表分组法将实验大鼠分为空白组(10只，行假手术后生理盐水10 mL/kg、1次/日灌胃)、模型组（10只，改良Hulth法造模后生理盐水10 mL/kg、1次/日灌胃）、透骨消痛胶囊组（10只，改良Hulth法造模后透骨消痛胶囊10 mL/kg、1次/日灌胃），连续灌胃治疗12周后取材。关节软骨整体形态观察，HE染色观察关节软骨形态结构变化，甲苯胺蓝染色观察关节软骨中蛋白多糖变化，ELISA检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13表达。
　　2.4周龄SPF级SD雄性大鼠10只，机械-Ⅱ型胶原酶消化法分离提取大鼠软骨细胞，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定，建立大鼠软骨细胞体外培养。ELISA检测IL-1β、TNF-α确立LPS诱导建立炎症性软骨细胞模型的条件，透骨消痛胶囊干预浓度。体外培养软骨细胞，分为空白组、模型组(10 ng/ml LPS)、抑制剂组（10μmol/ml SB203580干预30min后加入10 ng/ml LPS）、透骨消痛胶囊组(10ng/ml LPS+300μg/ml透骨消痛胶囊)，干预8h。
　　ELISA检测各组软骨细胞上清液中IL-6、MMP-9、TIMP-1表达量，QRT-PCR检测各组软骨细胞miRNA-140、miRNA-27b、miRNA-146a表达，Western-blot检测各组软骨细胞p-p38 MAPK、p38 MAPK、MMP-13、MMP-3、ADAMTS4、ADAMTS5表达，免疫荧光染色观察各组软骨细胞p-p38 MAPK、p38 MAPK、MMP-3、ADAMTS4表达，QRT-PCR检测各组软骨细胞p38 MAPK、MMP-13、MMP-3、ADAMTS4、ADAMTS5表达。
　　结果：
　　1.膝关节滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-13表达，模型组明显高于空白组(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛胶囊组明显低于模型组（P＜0.05、 P＜0.01），透骨消痛胶囊组与空白组之间无明显差异(P＞0.05)。甲苯胺蓝染色显示空白组大鼠关节软骨染色较深且均匀，模型组出现大范围失染，透骨消痛胶囊组染色深浅介于空白组和模型组之间。HE染色显示空白组大鼠关节软骨形态完整，软骨细胞排列整齐，未见软骨细胞肥大分化。模型组关节软骨表面局部粗糙不平，软骨层变薄，软骨细胞裸露、排列絮乱、出现肥大分化现象。透骨消痛胶囊组关节软骨浅表层基本完整，层次清晰可辨，软骨细胞状态介于空白组与模型组之间。空白组关节软骨整体形态完整，模型组关节软骨出现明显破损、关节周围有骨赘形成，透骨消痛胶囊组关节软骨整体相对完整、未见骨赘形成。
　　2.脂多糖诱导炎症性软骨细胞模型建立条件确定为10 ng/mL干预8h，透骨消痛胶囊干预浓度确定为300μg/mL。软骨细胞上清液MMP-9、IL-6的表达模型组高于空白组(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛胶囊组低于模型组（P＜0.05、P＜0.01）。软骨细胞上清液TIMP-1的表达，模型组低于空白组(P＜0.05)，透骨消痛胶囊组显著高于模型组(P＜0.01)。软骨细胞miRNA-140、miRNA-27b的表达，模型组显著低于空白组(P＜0.01)，透骨消痛胶囊组显著高于模型组(P＜0.01)。软骨细胞miRNA-146a的表达，模型组显著高于空白组(P＜0.01)，透骨消痛胶囊组低于模型组(P＜0.05)。软骨细胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达，模型组高于空白组(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛胶囊组低于模型组(P＜0.05)。软骨细胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、p38 MAPK基因的表达，模型组高于空白组(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛胶囊组低于模型组(P＜0.05、P＜0.01)。
　　结论：
　　1.透骨消痛胶囊通过调控软骨细胞miRNA-140、miRNA-27b、miRNA-146a表达进而介导炎症反应，抑制软骨基质降解蛋白的表达，维持软骨基质稳态，延缓骨关节炎关节软骨退变。
　　2.透骨消痛胶囊通过调控p38 MAPK信号通路，抑制炎症反应所介导的软骨基质稳态失衡。

目录

声明

中英文缩略词

摘要

前言

实验一 透骨消痛胶囊对骨关节炎大鼠软骨基质及关节软骨形态的影响

1 实验材料

1．1 实验药物

1．2 实验试剂、耗材

1．3 实验仪器

2 实验动物

3 实验方法与步骤

3．1 实验动物造模、分组与给药

3．2 实验动物取材

3．3 指标检测

3．4 数据统计

4 实验结果

4．1 关节软骨整体形态观察

4．2 HE染色观察膝关节软骨组织形态

4．3 甲苯胺蓝染色观察关节软骨蛋白多糖变化

4．4 ELISA检测滑膜组织IL-1β、TNF-α、MMP-13表达

5 讨论

6 小结

实验二 透骨消痛胶囊对炎症性软骨细胞miRNAs及MMPs、ADAMTS表达的影响

1 实验材料

1．1 实验药物

1．2 实验动物

1．3 实验试剂与耗材

1．4 实验仪器

2．1 实验试剂的配制

2．2 大鼠软骨细胞的分离培养与鉴定

2．3 LPS诱导炎症性软骨细胞模型时效、量效的确立

2．4 透骨消痛胶囊干预炎症性软骨细胞模型浓度的确立

2．5 实验分组及干预方法的确立

2．6 透骨消痛胶囊对炎症性软骨细胞模型影响的检测

2．7 数据统计

3 实验结果

3．1 软骨细胞鉴定

3．2 LPS诱导炎症性软骨细胞模型的建立

3．3 透骨消痛胶囊干预LPS诱导炎症性软骨细胞模型浓度的确定

3．4 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞IL-6、MMP-9、TIMP-1表达

3．5 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞miRNAs的表达

3．6 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞相关蛋白表达

3．7 免疫荧光观察透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞MMP-3、ADAMTS4、p38 MAPK、P-p38 MAPK蛋白表达

3．8 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞相关基因表达

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

文献综述 炎症因子介导软骨基质稳态失衡机制研究进展

致谢

作者简历