人表皮和毛囊的细胞培养及黑素细胞重编程的研究

摘要

目的：
　　(1)观察表皮细胞在三种培养基中的生长状况，检测不同时间点培养上清中内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）和干细胞因子（Stem cell factor，SCF）的水平；
　　(2)连续观察成人头皮毛囊外根鞘（Outer root sheath, ORS）和毛乳头(Dermal papilla,DP)细胞的生长及形态学变化；
　　(3)采用3个因子转染人表皮黑素细胞（melanocytes, MCs）成为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。
　　方法：
　　(1)采用3种培养基培养表皮细胞，分别在培养24h、48h、72h、96h时收集培养上清，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法检测ET-1和SCF水平，同时比较不同培养基中细胞的生长状态；
　　(2)利用两步酶消化获得正常人头皮毛囊的ORS和DP，采用添加人角质形成细胞生长添加物（human keratinocyte growth supplement，HKGS）和人黑素细胞生长添加物（human melanocyte growth supplement，HMGS）的K-SFM进行体外培养，倒置显微镜下连续观察毛囊ORS和DP的迁移和生长；
　　(3)用分别携带Oct4、Klf-4和c-Myc因子的慢病毒载体转染人表皮MCs，对生成的克隆进行碱性磷酸酶染色（AP）、甲基化水平检测、干细胞标记相关抗体的免疫荧光染色、透射电镜观察超微结构、体外诱导三胚层分化。
　　结果：
　　(1)三组培养上清中，培养基2（M2）中上清ET-1的含量最高；随着时间延长ET-1含量均增加，三组间比较差异有统计学意义（P＜0.01）；三组培养上清中SCF含量在第24～48小时含量显著下降，三者之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。换液后ET-1和SCF变化趋势基本同换液前（P＜0.01）。M2中细胞增殖最快，角质形成细胞（keraticytes, KCs)呈集落样生长，MC的树突较多。培养基1(M1)中贴壁细胞数目少，死亡细胞多，细胞增殖缓慢，KCs散在，MCs多是双极。培养基3（M3）细胞生长情况介于M1和M2两组之间；
　　(2)将单个毛囊置于预先涂布血清的培养板2小时，然后添加少量培养基，毛囊粘附于培养板的几率增加，数小时后，即可见细胞从ORS及DP处迁移生长，以KCs、成纤维细胞(fibroblasts, FBs)为主，MCs较少。并且，ORS和DP的迁出和生长有明显不同。如果培养基过多，则多数毛囊悬浮，无细胞迁出，最终死亡。
　　(3)采用携带Oct4、Klf-4和c-Myc因子的3个慢病毒载体转染人表皮MCs，转染后第6天，开始形成克隆。第1代和第3代iPSCs的AP染色为阳性；与母本相比，Oct4和Nanog基因位点部分去甲基化，透射电镜观察可见细胞增生活跃，部分细胞中有3个核仁，极少数细胞的细胞浆中可见散在I和II期黑素体。将第5代iPSCs悬浮培养获得拟胚体，后者贴壁培养后，干细胞相关抗体染色显示Sox2阳性、Cdy1强阳性。用第5代克隆进行诱导分化，在分化后2周，显示代表脂肪细胞的油红染色阳性，代表肝细胞的白蛋白染色阳性，但代表神经元标记的相关染色阴性。
　　结论：
　　(1)培养基中高水平ET-1有利于表皮细胞的贴壁、增殖和分化。在培养过程中表皮细胞能够分泌ET-1，并释放入培养上清。表皮细胞培养消耗SCF，但无明显表皮分泌作用。
　　(2)预先涂布血清和开始仅添加少量培养基，有利于毛囊粘附，随后细胞迁移生长。
　　(3)携带3个因子的慢病毒转染人表皮MCs，可以产生不完全型的iPSCs，表达大部分干细胞的性能，体外也能诱导成脂肪细胞、肝脏细胞，但没有成功诱导成神经元细胞。

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引言

第一部分 表皮细胞培养上清中ET-1和SCF含量的检测

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 人毛囊外根鞘及毛乳头细胞的迁移和生长观察

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

第三部分 人表皮黑素细胞重编程为多潜能干细胞的研究

1．实验材料和方法

2、结果

3、讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录

附录A 缩略词表

附录B 主要试剂配制方法

附录C 自我介绍及其他

附录D综述: 毛囊隆突区干细胞壁龛的研究进展