小麦近缘种LMW-GS基因克隆与HMW-GS功能的体外研究

摘要

小麦胚乳贮藏蛋白对小麦品质具有重要作用，特别是高、低分子量谷蛋白亚基与面粉加工品质和烘烤品质密切相关。目前，有关高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的报道较多，而对低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的研究相对较少。本研究包括两部分内容：一是从小麦近缘种中分离克隆新的低分子量谷蛋白亚基基因，分析其结构特征和分子进化关系。二是研究单个高分子量谷蛋白亚基功能的体外微量配粉检测方法。利用PCR克隆的方法从野生二粒小麦和粗山羊草中扩增克隆了一个LMW-i型亚基基因和三个LMW-m型亚基基因，获得了全基因编码序列，并进行序列比较和分子进化分析。采用10g揉面仪，将单个高分子量谷蛋白亚基回收纯化后整合到对照面团中，测定其揉面特性的变化，进而研究单个高分子量谷蛋白亚基的功能特性，以期为进一步研究谷蛋白亚基功能和品质改良提供一种方便可行的方法。主要研究结果如下： ●LMW-GS基因的分离克隆与分子进化分析利用SDS-PAGE和质谱技术对小麦近缘种中的低分子量谷蛋白亚基进行鉴定，然后利用一对特异的LMW-GS基因引物进行AS-PCR扩增，从野生二粒麦Y21中扩增出两条特异带，长度为1000bp左右；从三个粗山羊草T132、T128和T121中分别扩增出一条特异带，长度900bp左右，根据推导出的氨基酸序列分子量大小可确定为C区的低分子量谷蛋白亚基。经序列测定得到4个基因编码区全序列，分别为1021bp、918bp、921bp和918bp。基因序列分析表明，所得基因均为完整的LMW-GS基因序列。LMW-Y21基因的编码区含有一个终止密码子，为沉默基因。根据N-端氨基酸序列，发现LMW-Y21中信号肽后第一个氨基酸是异亮氨酸，为LMW-i型亚基。从粗山羊草中克隆得到的基因编码的蛋白，信号肽后的第一个氨基酸是甲硫氨酸，为LMW-m型亚基。将三个功能基因与从Genebank中调取的6个典型LMW-GS基因进行序列比较，克隆的基因具有m型LMW-GS典型的结构特点，编码区依次由信号肽、区域Ⅰ、区域Ⅱ、区域Ⅲ、区域Ⅳ和区域Ⅴ六部分组成。LMW-Y21具有i型LMW-GS基因典型的特点，缺少区域Ⅰ。在这些基因中，LMW-Y21的8个半胱氨酸残基全部位于C-端区域，这是LMW-i型亚基所具有的典型特征。 LMW-T132-1、LMW-T128和LMW-T121的8个半胱氨酸残基中有一个位于重复区域的第五个氨基酸位置上，其余的7个全部位于C-端区域，这也是LMW-m型亚基所具有的典型特征。利用生物软件DNAMAN进行进化分析，结果表明，LMW-m型和LMW-s型基因与LMW-i型基因首先分离，可以推测LMW-m型和LMW-s型亲缘关系比较近。另外，LMW-T132-1和LMW-T121和LMW-s型亚基聚在一起，说明它们具有较高的同源性。 ●HMW-GS功能的体外微量鉴定利用SDS-PAGE方法从硬粒小麦品种“Simeto”和面包小麦品种“中优9507”中回收单个HMW-GS，包括1Ax1、1Dx5、1Bx7、1By8、1By9和1Dy10亚基。然后通过10g揉面仪将回收的蛋白亚基采用还原氧化法整合到品种“京411”面团谷蛋白多聚体结构中，分析揉面参数的变化，进而确定不同蛋白亚基对小麦面团品质的影响。研究结果表明，添加蛋白亚基后面团的揉面时间都有所增加，而稳定时间增加明显，证明这几个亚基对小麦面团的耐揉性与稳定性都有正向效应。但是，这几个亚基对小麦品质的影响程度不同，各个参数的变化也不一样，对面团特性影响的大小顺序为：1Dy10＞1Ax1＞1Dx5＞1By8＞1Bx7＞1By9亚基。

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