AFB1代谢关键酶的底物识别机制

摘要

黄曲霉毒素B1(AFB1)具有强烈的毒性和致癌、致畸和致突变性,是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素.猪作为国内养殖量与消费量最大的畜类动物,由于不可避免的饲料污染,极易遭受AFB1的毒害.细胞色素P450氧化酶(CYP)和黄曲霉毒素醛还原酶(AFAR)是AFB1在动物体内代谢的关键酶,分别在AFB1的活化和解毒过程中发挥至关重要的作用.目前，对于这两种关键酶识别和结合AFB1的机制缺乏深入了解。rn 首先利用原核系统表达纯化了猪CYP3A29.Fe2+-CO差光谱和尼福地平孵育实验证明其具有良好的结构和氧化活性。膜重构孵育实验证实3A29能氧化AFB1，形成AFB1-8,9-外环氧化物。这一结果表明重组猪CYP3A29具有体外活化AFB1的活性。利用定点突变和分子对接的方法进一步发现3A29主要通过Thr-309侧链与AFB1之间的氢键稳定AFB1在底物口袋的结合。与人CYP3A4不同，Phe-304侧链大的苯环对AFB1形成了空间位阻。而对于F304A，由于侧链的消失，AFB1与Ser-119形成了新的氢键，使结合更加稳定，对AFB的代谢活性增强。在AFB1的解毒代谢研究中，首次表达纯化了猪AFAR，该酶具有代谢2-羧基苯甲醛和琥珀酸半醛的活性。利用定点突变和分子对接证明Trp-266对于AFAR结合AFB1-二醛发挥关键作用。在M86A中，由于Met-86侧链的消失，Trp-266与AFB1分子形成了更为稳定的π-π作用，使突变体对AFB1一二醛的代谢增强。此外，结合口袋处的其它疏水氨基酸残基，如Trp-119和Ala-152等对于稳定AFB1-二醛的结合发挥辅助作用。研究对于理解猪肝脏关键代谢酶对AFB1的底物识别和结合的分子机制提供了重要参考。