黄瓜T-DNA插入突变体文库构建研究

摘要

黄瓜是首个完成基因组测序的园艺作物.为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文开展了黄瓜T-DNA插入突变体库构建的研究.以黄瓜栽培品种'长春密刺'子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的转化方法,将T-DNA插入突变载体pROK2转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化体系最适合的Kan筛选浓度;使用PCR和斑点杂交方法鉴定T0和T1代转化植株;以'长春密刺'植株为对照,调查统计T1代植株表型.确定100mg/L Kan为最适合的抗性芽筛选浓度;PCR检测结果显示,14S1和14S2两个T0代株系均整合了35S启动子和NPT-Ⅱ基因序列;14S1自交后获得55个T1代单株,对其进行PCR检测发现其中12个单株均扩增出了35s和NPT-Ⅱ片段;随机选取23个T1代单株,以Dig标记的35S和NPT-Ⅱ为探针对其进行斑点杂交检测,得到14S1-27和14S1-34两个单株有35S和NPT-Ⅱ杂交信号;性状调查统计显示,该两个T1代植株表现出叶片黄化和复雌花表型.pROK2重组质粒成功整合到了14S1,14S2两个株系的基因组中.对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测进一步证明了14S1为转化植株,确定14S1为插入突变体.结合TDNA插入位点鉴定技术和T1代植株表型可进一步开展相关基因分离及功能研究工作.