黄瓜遗传转化体系优化及T-DNA插入突变体创制

摘要

黄瓜(Cucumis sativus L.)是首个完成基因组测序的园艺作物，这使得黄瓜功能基因组学研究成为重点。功能基因组学研究最直接有效地方法之一是构建基因突变体库，通过研究突变体来分离基因、鉴定基因功能。插入突变是植物突变体库构建的重要手段，随着农杆菌介导的遗传转化技术的日益成熟和T-DNA插入位点鉴定方法的丰富完善，T-DNA插入已经成功用于多种植物插入突变体库构建的研究中。创制黄瓜T-DNA插入突变体对于研究黄瓜基因功能具有重要意义，也为葫芦科其他作物功能基因组学研究提供有力参考。
　　T-DNA插入是在农杆菌介导的遗传转化的基础上实现的，而黄瓜遗传转化主要采用农杆菌介导法。因此，建立高效稳定的黄瓜遗传转化体系是创制黄瓜T-DNA插入突变体的前提条件。影响黄瓜遗传转化效率的因素有基因型、外植体类型、培养基成分、菌株及载体类型、茵液浓度、侵染时间、预培养及共培养时间和筛选压力等，其中培养基成分主要包括:无机营养物、有机营养成分、生长调节物质、固化剂和其他添加剂等。目前，黄瓜遗传转化效率还较低。研究人员从生长调节物质、培养条件和筛选压力等方面对黄瓜遗传转化体系优化开展了大量的研究，但在固化剂、抗氧化剂和有机添加物等方面研究较少。本研究从培养基成分入手，通过改变培养基固化剂、添加抗氧化剂和有机添加物的方式，对农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系进行优化，提高了遗传转化效率。在此基础上，以植物突变体构建常用表达载体pROK2为T-DNA插入突变载体转化黄瓜，并获得了插入突变体，为构建黄瓜插入突变体库、研究黄瓜基因功能奠定重要基础。具体研究内容及结果如下:
　　1.农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化
　　在实验室已经建立的黄瓜遗传转化体系的基础上，通过Kan敏感试验，确定黄瓜栽培品种‘长春密刺’抗性芽的最适筛选压力为100 mg/L。通过改变培养基固化剂、添加抗氧化剂和有机添加物的方式，对农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系进行优化。结果发现在脱乙酰吉兰糖胶为固化剂的培养基上‘长春密刺’的抗性芽诱导率比以琼脂粉为固化剂的培养基诱导率高28.21％;共培养基中添加50 mg/L抗氧化剂α-LA时，‘长春密刺’抗性芽诱导率最高达66.67％，平均芽分化数最高达1.32;在选择培养基中添加1.5 g/L的有机添加物CH，‘长春密刺’抗性芽诱导率和平均芽分化数最高，分别为67.15％和1.42。综上，本研究得到了以脱乙酰吉兰糖胶为培养基固化剂，共培养基中添加50 mg/Lα-LA或选择培养基中添加1.5 g/L CH的优化的遗传转化体系，外植体抗性芽诱导高于实验室之前的研究44.40％。
　　2.黄瓜T-DNA插入突变体的创制
　　以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体，采用优化的农杆菌介导的遗传转化方法，用T-DNA插入突变载体pROK2转化黄瓜;使用PCR和斑点杂交方法鉴定T0和T1代转化植株;以‘长春密刺’未转化植株为对照，调查统计T1代植株的表型。T0代PCR检测结果初步证明了14S1、14S2两个株系均整合了35S启动子和NPT-Ⅱ基因序列;T1代PCR检测结果显示14S1自交后代55个单株中12个单株均扩增出了35S和NPT-Ⅱ片段;以Dig标记的35S和NPT-Ⅱ为探针对这12个单株及随机选取剩余单株中的11株进行斑点杂交检测，得到14S1-27和14S1-34两个单株有35s和NPT-Ⅱ杂交信号;性状调查统计显示，T1代植株表型与对照植株没有明显的差异。综合结果表明pROK2重组质粒成功整合到了14S1株系的基因组中，对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测进一步证明了14S1为转化植株，确定14S1为T-DNA插入突变体。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

第一章 文献综述

1 黄瓜功能基因组学研究进展

1．1 EST在黄瓜功能基因组学研究中的应用

1．2 TILLING技术在黄瓜功能基因组学研究中的应用

1．3 DNA芯片在黄瓜功能基因组学研究中的应用

2 植物突变体库构建方法

2．1 理化诱变

2．2 基因沉默

2．3 插入突变

3 农杆菌介导的黄瓜遗传转化影响因素

3．1 影响黄瓜再生频率的因素

3．2 影响黄瓜转化效率的因素

4 展望

参考文献

第二章 农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果和分析

2．1 Kan筛选压力的确定

2．2 Gellan gum对黄瓜子叶节芽分化的影响

2．3 α-LA对黄瓜子叶节抗性芽分化的影响

2．4 CH对黄瓜子叶节抗性芽分化的影响

3 讨论

参考文献

第三章 黄瓜T-DNA插入突变体的创制

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化再生过程

2．2 T-DNA插入突变体植株鉴定

2．3 T1代植株表型观察

3 讨论

参考文献

全文结论

论文创新点

工作展望

硕士期间发表论文

致谢