实时荧光定量TaqMan-PCR检测鹅细小病毒方法的建立

摘要

目的：本研究旨在建立一种适用于鹅细小病毒检测的荧光定量TaqMan-PCR技术.rn 方法：根据GenBank中首次发现的鹅细小病毒SYG61株VP3基因的全序列(序列号:DQ299421),设计一对特异性引物及TaqMan探针,扩增位于VP3基因第1380-1459位长度为80-bp的片段.以SYG61株DNA为模板,建立检测鹅细小病毒的实时荧光定量PCR方法.构建含有上述目的片段的质粒作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性.同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测.与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测,并将GPV GD株毒液倍比稀释后经鸭胚接种,收获其尿囊液进行检测,以确定该方法的可行性.rn 结果：本文所构建的荧光定量TaqMan-PCR方法能在鹅细小病毒SYG61株DNA样本中检出荧光信号。最低检出量为1.56×l01拷贝／反应；线性范围达9个数量级。采用质粒标准品106~102拷贝／μl这五个稀释度进行重复性检测，每个稀释度五个重复，所得批内变异系数为0.38%-0.74%；相同的五个样品连续三天每天复检一次，所得批间变异系数为1.23%~2.48%。检测禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒l型、鸭甲型肝炎病毒3型、禽白血病病毒、鸭坦布苏病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、产蛋下降综合征病毒和传染性法氏囊病病毒等非鹅细小病毒，均未出现非特异性荧光信号。将GPV GD株毒液倍比稀释为100、10-1和10-2，每个稀释度接种三枚9日龄鸭胚，六日内死亡率为88.9%(8/9)，收获尿囊液进行检测，GPV检出率为100%(9/9)，Ct值范围在21.03-28.55之间。rn 结论：本方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可在获得样品后三小时以内得到检测结果，因此适用于临床样品中的鹅细小病毒快速检测。