嗅球来源嗅鞘细胞冻存方法的研究

摘要

目的：探索嗅球来源嗅鞘细胞的低温冷冻保存方法,寻找最佳的冷冻保护剂种类和浓度,降温方法及速率,提高冻存复苏后细胞的存活率和贴壁率,为临床上人胚胎嗅鞘细胞保存提供指导.材料与方法：取出生24h内SD大乳鼠嗅球,用改良Nash差速贴壁法+Ara-c对细胞进行培养纯化,以P75、GFAP染色鉴定.收集处于对数生长期OECs,调整细胞密度5×106/ml备用.A组采用传统慢冻方法:5％DMSO+6％HES作为冰冻保护剂,4℃30～60min,-20℃1～2h,-80℃过夜,然后置于液氮内;B组采用玻璃化法:20％(v/v)DMSO,20％(v/v)EG,10％(w/v)乙酞胺,0.5M海藻糖为冰冻保护剂,程控降温仪降温则以1℃/min的降温速率降至-40℃,再以10℃/min的降温速率降至-80℃,然后投入液氮内保存.两周后快速复温至37℃,经台盼蓝拒染法、MTT比色法检测细胞复苏率,绘制生长曲线比较细胞增殖能力.结果：在复苏率方面,A组74.3 ％;B组86.9％,两组具有统计学显著性差异(P＜0.05)贴壁率:A组9.72％;B组10.22％,两组无统计学差异.在增殖能力方面B组也明显优于A组.结论：采用玻璃化法对嗅鞘细胞进行冻存,是一种高效可行的方法,冻存细胞经快速符文,可达到较高的复苏率,对于复苏细胞的增殖能力也没有很大的影响.然而玻璃化需要较高的保护剂浓度,DMSO对细胞有毒性,其毒性作用随浓度的增大,低温可以减轻其毒性作用.因此使用之前需在4℃下进行预冷,复苏后也应及时洗脱保护剂.较高的溶质浓度同样也会造成细胞内外渗透压梯度过大,造成细胞脱水过快、皱缩,不利于细胞活性的维持.因此可以采用多次导入的方法,是的冰冻保护剂浓度逐渐上升.冻存细胞是,细胞密度较一般培养为高,可以提高抗冻性.在复苏后,换液时应加大培养液血清浓度,避免细胞密度过大营养不足造成凋亡.