SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用

摘要

根据GeneBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR),用于CDV的定量检测。以含有87bp扩增产物的pGM-T载体质粒为阳性对照,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,及与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行比较研究。 结果表明,该方法具有良好的特异性,只能从CDV阳性样本检出阳性信号,PCR产物经凝胶电泳、克隆、测序,证实为CDV的特异片断；检测的线性范围广,在5.2×102～5.2×107拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.9998；敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍；重复性好,组内变异系数为0.51～1.90％,再现性好,组间变异系数为1.96～2.63％。用建立的RRT-PCR检测11例犬瘟热临床疑似病例,阳性率为11/11,随机抽取3份阳性样本的扩增产物测序,证明为CDV的特异序列,而GIA检测的阳性率为10/11；用建立的RRT-PCR对犬二联、四联、五联、六联弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24×105～4.88×105拷贝/头份之间。本研究为CDV临床样本提供了快速、特异、敏感的检测手段,也为CDV的定量研究奠定了基础。