鉴别诊断禽流感野毒感染与疫苗接种的ELISA方法的建立

摘要

根据GenBank公布的禽流感病毒(AIV))序列设计引物,用PCR方法扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的非结构基因-NS1基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中,获得了重组表达质粒PET-NS1.阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,高效表达了NS1蛋白,目的蛋白以包涵体的形式存在。确定了工程菌的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为5 h.Western-blot分析表明重组AIV NS1蛋白具有良好的抗原性,NS1融合蛋白经His-bind柱子纯化后获得纯度较高的NS1蛋白。并以此作为诊断抗原包被酶标板,建立了检测AIV NS1蛋白抗体的间接ELISA方法。该ELISA能区分禽流感病毒感染鸡和禽流感灭活疫苗接种鸡的血清样品,但不能区分感染禽流感的亚型。进一步试验确定了重组抗原最佳包被浓度为1.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗的最佳工作稀释度为1∶2000.初步确定阳性判定标准为,待检血清OD490＞0.3,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.1.因此,本研究应用AIVNS1蛋白初步建立区分禽流感病毒感染和灭活疫苗免疫鸡血清样品的ELISA,为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了一种特异敏感的方法。