抗登革病毒抗体制备与鉴定、滴定方法的研究

摘要

以登革病毒1型(DENV-1)cDNA为模板,构建表达质粒。以原核表达系统快速、大量制备谷胱甘肽S-转移酶-病毒结构或非结构融合蛋白GST-M和GST-NS3.二者分别作为免疫原制备的兔多克隆抗体,可用于免疫荧光实验检测DENV.以WB和IFA法对4种多克隆抗体及1种单克隆抗体的特异性和灵敏性进行鉴定。结果表明:(1)抗M多抗主要识别DENV-1型(对2型有微弱交叉反应)的M和prM蛋白;(2)抗NS3多抗及抗NS3单抗均可与四种血清型交叉反应,二者免疫荧光信号均较强。(3)抗E, NS1多抗均可识别DENV-1型,滴度和特异性较NS3抗体低。由于抗NS3单抗的荧光本底值最低,故选择将其应用于荧光滴定实验。为建立可靠、有效的病毒滴定方法,依次采用CCID50,FFA,CCID5o-FFA,qRT-PCR法对病毒滴度或RNA拷贝数进行测定。CCID50-FFA法将CCID5.与FFA实验结合可明显缩短病毒滴定时间,减少人为判定误差。qRT-PCR法首先以体外转录法制备RNA标准品,之后采用TaqMan探针法对已知滴度病毒RNA拷贝数进行绝对定量。根据反应结束后Ct值,分别建立RNA标准品和病毒液的标准曲线。比较二者间的平行关系,进而计算出DENV-1 P14代病毒液1 CCID50/mL对应RNA拷贝数为205.7.