蓝舌病病毒核酸通用检测方法的建立

摘要

目的：建立具有群特异性的BTV通用核酸检测方法，为有效的防控蓝舌病奠定了基础。方法：利用DNAMAN生物学软件，比对了GenBank中26个不同血清型BTV的共104条S10基因的核酸序列，选取最保守的序列区域设计特异性引物，并利用PubMed中的BLAST软件将设计的引物与GenBank中病毒的核酸序列进行比对，以分析其特异性。利用设计的特异性引物对BTV1-24共24个血清型毒株的RNA用Quant One Step RT-PCR Kit进行one stepRT-PCR检测，以验证该引物的通用性。同时，以IBAV,CV和AKAV的RNA为模板，进行one step RT-PCR检测，以验证该引物的特异性。并通过已知浓度的BTV-16的RNA样品，按照确定的检测体系进行one step RT-PCR检测，以测定该方法的灵敏度。对人工感染BTV-16的46份羊的抗凝血样品用QIAampRNA Blood Mini Kit进行RNA提取，并进行one step RT-PCR检测。每组实验进行三次重复。结果:通过试验成功设计了BTV核酸特异性通用检测引物，并成功建立了BTV群特异性one step RT-PCR检测方法。该方法可有效检测出不同血清型BTV核酸，而对IBAV,CV和AKAV无交叉反应，特异性好;同时，该方法可成功检测到102 TCID50/mL的BTV核酸;该方法也可有效检测出羊的抗凝血样品中的BTV核酸。结论:通过比对104条26个不同血清型BTV S10基因的核酸序列，其同源性可高达90. 55%，并在不同血清型BTV中存在两段高度保守的核酸区域，这为设计BTV特异性通用检测引物提供了有利的基础。本实验筛选得到的一对特异性引物对BTV1-24型都发生特异性反应，具有良好的群特异性，为建立快速、敏感、特异性的BTV通用核酸诊断方法奠定了基础。