siIRE1α重组腺病毒构建及对C2C12细胞增殖凋亡的影响

摘要

目的:构建内质网跨膜蛋白肌醇酶1α基因干扰RNA(siRNA)重组腺病毒,在小鼠成肌细胞系C2C12中鉴定其干扰作用,并探讨其对C2C12细胞增殖凋亡的影响.方法:利用OligoEngine软件在线设计靶向IRElα的siRNA干扰序列,送公司合成.用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,酶切及基因测序鉴定.经pmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1通过电转法在大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组,得到pAd-SES-HUS-IRE1αsiRNA重组质粒,pacⅠ酶切鉴定.通过脂质体介导感染HEK293细胞,进行包装并扩增重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA,然后感染C2C12细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对IREl mRNA和蛋白表达的干扰效果.并通过FCM法检测在有和无Tm(tunicamycin)的条件下,对C2C12细胞增殖凋亡的影响.结果:酶切及基因测序证实,成功构建了pAd-IRE1αsiRNA重组干扰质粒,得到高滴度的Ad-IRE1αsiRNA重组腺病毒,病毒滴度约为4.3×1011;RT-PCR和Western Blot结果表明,该重组腺病毒有效的抑制了C2C12细胞中IRE1的表达;FCM检测结果表明,ERS条件下,Tm+Ad-IRE1αsiRNA处理组G1期的细胞比例分别比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组低14.47％和15.82％(P＜0.5),S期的细胞比例分别比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组高12.62％和14.80％(P＜0.5);凋亡率比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组低出16.64％和16.26％(P＜0.5).结论:成功构建了靶向IRE1αsiRNA的重组腺病毒,在C2C12细胞中实现了IRE1α表达的抑制;RNA干扰IRE1α基因可促进C2C12细胞的增殖,抑制其凋亡.为进一步研究IRE1基因功能奠定了基础,也为内质网应激相关的骨骼肌疾病提供了一定的参考价值。